Herstellung einer Agrobakterienkultur zur Genlieferung in Pflanzenzellen

Zusammenfassung

Quelle: Shi, J. et al., Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Herstellung einer Agrobacterium tumefaciens-Kultur , indem eine Virulenzgenexpression mit Acetosyringon induziert wird, gefolgt von der Antibiotikaentfernung durch Waschen und Resuspension, um eine transformationsbereite Suspension für die Genlieferung in Pflanzengewebe zu erzeugen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Agrobacterium-Kultur für die Infiltration

1. Nehmen Sie eine positive Kolonie von der Luria-Bertani (LB)-Platte und inokulieren Sie die Zellen in ein Glasröhrchen mit 5 mL LB-Medium, ergänzt mit 50 μg/mL Kanamycin und 50 μg/mL Rifampicin. Wachsen Sie die Zellen bei 30 °C und schütteln Sie sie bei 200 U/min für 24−48 Stunden.
2. 100 μL Kultur werden in 5 mL LB-Medium übertragen, das mit denselben Antibiotika ergänzt wird, 10 mM 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonsäure (MES; pH 5,6) und 20 μM Acetosyringon (AS). Bakterien bei 30 °C mit Schütteln bei 200 U/min für 16−20 Stunden wachsen lassen.
3. Zentrifugiere Zellen mit 4.000 x g für 10 Minuten. Gieße das Überstandsmittel ab und suspendiere das Pellet in 2 mL 10 mM MgCl_2-Puffer .
4. Wiederholen Sie Schritt 1.3, um die vollständige Entfernung der Antibiotika sicherzustellen.
5. Bestimmen Sie die Dichte der Agrobacterium-Kultur , indem Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) messen. Anpassen Sie auf einen OD₆₀₀ von 1,5−2,0 mit einem Puffer von 10 mM MgCl₂ .
6. Gib 10 mM MES (pH 5,6) und 150 μM AS zu den finalen Suspensionskulturen und inkubiere die Zellen bei RT mindestens 3 Stunden ohne Schütteln.
   HINWEIS: Lassen Sie die endgültigen Suspensionskulturen nicht über Nacht stehen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-Morpholinoethanesulfonsäure (MES)	Biofroxx	1086GR500	Puffer
Acetosyringon (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induktion von Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB Medium
Bacto-Trypton	BD Biosciences	211705	LB Medium
Bacto-Hefeextraktion	BD Biosciences	212750	LB Medium
Kanamycinsulfat	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotika
Rifampicin	MP Biomedizin	219549005	Antibiotika
Natriumchlorid	Amresco	0241-10KG	LB Medium