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Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.
Bildgebung der Blasen mittels Rasterelektronenmikroskopie
HINWEIS: Dieses Verfahren kann zu jedem Zeitpunkt durchgeführt werden, an dem eine Visualisierung des Urothels gewünscht ist. Wie in Abbildung 1 (violette Kästchen) dargestellt, sind uropathogene E. coli (UPEC)-urotheliale Interaktionen am besten zwischen 6 und 24 Stunden nach der UPEC-Inokulation während der Reservoirbildungsphase sichtbar, und die durch Gardnerella vaginalis ausgelöste Urothelexfoliation ist am besten zwischen 3 und 12 Stunden nach der zweiten G. vaginalis-Exposition sichtbar.
- In-situ-Blasenfixierung
- Bereiten Sie das Fixativ unmittelbar vor der Blasenernte vor, indem Sie Glutaraldehyd (2,5 % final) und Paraformaldehyd (2 % final) in einen 0,15 m Natriumkakodylatpuffer mit 2 mM CaCl2 bei pH 7,4 hinzufügen. Verwenden Sie Paraformaldehyd und Glutaraldehyd aus neu geöffneten Glasampullen, da beide Fixierungsmittel im Laufe der Zeit in geöffneten Behältern oxidieren. VORSICHT: Glutaraldehyd ist giftig, ein respiratorischer Reizstoff und korrosiv; Paraformaldehyd ist brennbar, krebserregend, ein Reizstoff und ein Fortpflanzungstoxin; Natriumkakodylat ist giftig und krebserregend.
- Um 50 ml Fixationslösung herzustellen, fügen Sie 6,25 ml 16 % Paraformaldehyd, 2 ml 50 % Glutaraldehyd und 16,75 ml ultrareines Wasser zu 25 ml einer 0,3 M großen Lösung von Natriumkakodylat bei pH 7,4 mit 4 mM CaCl2 hinzu.
- Erwärmen Sie das vorbereitete Fixativ auf 37 °C, bevor Sie die Blase einreichen.
- Füllen Sie die Tuberkulin-Slipspitzenspritze mit einem Fixativ und befestigen Sie einen Katheter am Ende, wobei der Fasen zu den gegenüberliegenden Spritzenmarkierungen zeigt. Schneide den überschüssigen Schlauch 1–2 mm vom Nadelende ab und achte darauf, die Nadelspitze nicht freizulegen. Schnippen Sie die Spritze, um Blasen zu entfernen, drücken Sie den Pümpel, um Luft zu entsorgen, und füllen Sie den Katheter mit Fixativ über einem Mikrozentrifugenrohr, um eventuelle Fixierungsmittel für eine ordnungsgemäße Entsorgung aufzufangen.
- Betäuben und opfern die Maus mit einer zugelassenen Methode (z. B. zervikale Verrenkung unter Narkose). Legen Sie die Maus mit befestigten Beinen (mit Gummibändern oder Nadeln) auf die Sezierfläche. Öffnen Sie den Beckenbereich der Maus mit einer Pinzette und einer chirurgischen Schere, um die Blase freizulegen. Schiebe vorsichtig das angrenzende Fett beiseite, aber lass die Blase an Ort und Stelle.
- Halte die Spritze mit der dominanten Hand, wobei die Nadel nach unten zeigt und die Nadelschräge sowie die Spritzenmarkierungen von dir weg zeigen. Tauchen Sie die Katheterspitze in steriles Schmiermittel.
- Positioniere die Katheterspitze an der Harnröhrenöffnung und halte den Spritzenlauf in einem Winkel von 30–45° über dem Körper der Maus.
- Üben Sie mit einer sehr kleinen Uhrzeigersinnsbewegung mit der Spitze nach unten Druck aus und führen Sie den Katheter vorsichtig in die Harnröhre ein. Wenn die Katheterspitze in die Harnröhre eintritt, schwenkt man die Spritze zum Schwanz der Maus, während man den Katheter weiter in die Harnröhre schiebt, bis der Spritzenlauf parallel zur Arbeitsfläche ist. Der gesamte Katheternadelschaft (ohne die Basis) sollte in die Maus eindringen und die Katheterspitze im Blasenlumen positionieren.
- Langsam 50-80 μL Fixativ abgeben, wodurch die Blase wie ein Ballon aufbläht. Halte den Katheter an Ort und Stelle und hebe die Spritze leicht an, indem du die Spitze nach oben kippst.
- Mit der anderen Hand öffnen Sie einen Hämostat und schieben Sie einen Zinken unter die Katheternadel an der Schnittstelle der Harnröhre. Schließe den Hämostat teilweise, bis er gerade noch die Nadel berührt.
- Schieben Sie die Katheternadel vorsichtig aus der Blase, während Sie gleichzeitig den Hämostat festklemmen und vollständig verriegeln, um den Verlust des Fixativs zu verhindern.
- Greifen Sie den Hämostat so, dass er parallel zur Arbeitsfläche ist und die Blase darauf ruht. Heben Sie vorsichtig an und schneiden Sie vorsichtig unter dem Hämostat (auf der gegenüberliegenden Seite der Blase), um die Blase mit dem noch befestigten Hämostat zu entfernen.
- Blase wird eingesetzt und der Hämostat in ein Falcon-Rohr mit erwärmtem Fixativ befestigt. Stellen Sie sicher, dass die Blase vollständig in der Flüssigkeit untergetaucht ist und nicht gegen die Wände des Schlauchs gedrückt wird. Inkubieren Sie bei 4 °C für 24 Stunden.
- Blasenverarbeitung und Bildgebung mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
- Schneiden Sie die Blase mit einer gereinigten, doppelseitigen Rasierklinge mit Sagittal in zwei Teile und machen Sie einen zweiten Schnitt, der tangential zum Hämostat ist, um die Blase zu lösen. Das ergibt zwei Halbblasen-"Becher". Falls noch Fettpolster außen an der Blase vorhanden sind, entfernen Sie sie vorsichtig.
- Spülen Sie die Blase dreimal (jeweils 10 Minuten) im Natriumkakodylatpuffer (0,15 M, pH-Wert 7,4).
- Färben Sie das Gewebe mit 1 % Osmiumtetroxid in einem 0,15 M Kakodylatpuffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Osmium ist lichtempfindlich; Führen Sie diesen Schritt daher mit dem Färbegefäß in Folie umwickelt, um eine dunkle Umgebung zu erhalten.
VORSICHT: Osmiumtetroxid ist giftig und korrosiv für die Haut. Mach diesen Schritt in der Abzugshaube mit Handschuhen. - Spüle die Blase dreimal (jeweils 10 Minuten) in ultrareinem Wasser. Während dieser Schritte kann manchmal osmigiertes Öl auf der Wasseroberfläche sichtbar werden. Saugen oder Wicken lassen Sie dies ab, um eine Verunreinigung während der Trocknungsphasen zu verhindern.
- Trocknen Sie das Gewebe, indem Sie es jeweils 10 Minuten in eine graduierte Ethanolserie (50, 70, 90, 100 und 100 %) tauchen.
- Trocknen Sie das fixierte Gewebe mit einem Kritischpunkt-Trockner und führen Sie 12 CO2-Austausche mit der langsamsten Geschwindigkeit durch. Setze alle zusätzlichen Einstellungen auf langsam, außer beim Entlüftungsschritt, der auf schnell eingestellt ist.
- Schneiden Sie jede Blasenhälfte erneut mit einem sauberen, doppelseitigen Rasierer, um insgesamt 4 Stücke zu erzeugen, die Krümmung der Probe zu verringern, eine effizientere Beschichtung zu ermöglichen, die Bildgebung im SEM zu erleichtern und Gewebe freizulegen, das sich beim Trocknen gekrümmt haben könnte.
- Klebe die Blasenstücke an einer leitfähigen Kohlenstoff-Klebelasche auf einem Aluminiumstab und streichen Sie mit einem Zahnstocher eine kleine Menge Silberkleber um den unteren Kontakt, wobei Sie darauf achten, dass überschüssiger Kleber nicht auf die Innenseite der Blase abzieht.
- Verwende einen Hochvakuum-Sputter-Coater, um die Probe-Stubbe mit 6 nm Iridium zu sputtern. Wenn die Proben weiterhin laden, sollte ein leitfähiger Weg mit silberner Farbe auf die Oberfläche aufgetragen und zusätzlich 4 nm Iridium aufgetragen werden.
- Fotografieren Sie die Proben mit einem Rasterelektronenmikroskop. Obwohl die Bedingungen je nach verwendetem Mikroskop variieren können, funktionierte eine Beschleunigungsspannung von 3 KeV mit einem Strahlstrom von 200 pA und einem Arbeitsabstand von 12–13 mm bei einem Zeiss Merlin FE-SEM bei Verwendung des Everhart-Thornley (SE2) Elektronendetektors gut.
