Isolierung und Kultivierung von Bakterien aus Zebrafisch-Embryonen zur Einschätzung der Infektionslast

Zusammenfassung

Quelle: Bernut, A., et al., Entschlüsselung und Bildgebung der Pathogenese und Cording von Mycobacterium abscessus in Zebrafisch-Embryonen. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Isolierung und Quantifizierung des Mycobacterium abszescessus aus einem infizierten Zebrafischembryo. Das Verfahren umfasst Embryonen-Euthanasie, Gewebelyse und Homogenisierung zur Freisetzung der Bakterien, gefolgt von Zentrifugation und Resuspension in einem Tensidpuffer. Abschließend wird die bakterielle Suspension seriell verdünnt, auf antibiotika-supplementiertem Agar aufgetragen und inkubiert, um die Bildung und Quantifizierung der Kolonie zu ermöglichen.

Protokoll

1. Vorbereitung und Lagerung des M. abscessus Inoculum
   1. Wachstumsbedingungen von M. abscessus
      1. Schichten Sie M. abscessus aus einem -80°C Glycerolstock auf einen Middlebrook 7H10-Agar mit 10 % OADC und 0,5 % Glycerol (7H10OADc) und ergänzen Sie das passende Antibiotikum je nach Resistenzmarker, der vom Vektor für das fluoreszierende Protein codiert. Inkubieren Sie die Platten bei 30 °C für 4-5 Tage.
      2. Nehmen Sie eine fluoreszenz-positive Mykobakterienkolonie auf und inokulieren Sie 1 ml Middlebrook 7H9-Brühe mit OADC, 0,2 % Glycerol, 0,05 % Tween 80 (7H9OADc/T) mit dem erforderlichen Antibiotikum in einem 15 ml sterilen Kunststoffschlauch. Inkubiere bei 30 °C eine Woche lang ohne Schütteln.
         HINWEIS: Tween 80 begrenzt Klumpbildung und bakterielle Ansammlung.
      3. Suspendieren Sie die Vorkultur, die in 2.1.2 in 50 ml Middlebrook 7H9OADc/T in 150 cm² Gewebekulturkolben erhalten wurde, auf eine endgültige 0,1 OD₆₀₀ (entspricht etwa 5,107 Bakterien/ml) und inkubieren Sie anschließend bei 30 °C für 4 Tage, um eine exponentiell wachsende Kultur (OD₆₀₀ = 0,6 bis 0,8) zu erhalten.
         HINWEIS: Um das Klumpen, insbesondere bei der rauen Variante, zu minimieren, sollte die Brutzeit nicht länger als 5 Tage dauern. Sowohl glatte als auch raue Varianten zeigen eine ähnliche Wachstumsrate.
2. Herstellung des M. abscessus inocula
   HINWEIS: Aufgrund der hohen Neigung des rauen M. abscessus , große Aggregate zu bilden und Nabelschnüre zu bilden, ist eine spezielle Behandlung notwendig, um vor Mikroinjektionen in den Embryonen homogene und quantitativ kontrollierte Inokula zu erzeugen. Diese Behandlung wird auch bei glatten Bakterien angewendet, die Aggregate produzieren, wenn auch in geringerem Maße als der Rohstamm.
   1. Entnehmen Sie exponentiell wachsende Kulturen aus 150 cm² Gewebekulturkolben durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 15 Minuten bei RT in einem 50 ml sterilen Kunststoffrohr und suspendieren Sie das bakterielle Pellet in 1 ml 7H9OADc/T erneut. Aliquot 200 μl bakterielle Suspensionen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren.
      HINWEIS: Die Arbeit mit kleinen Volumina in 1-ml-Spritzen ist notwendig, um hochhomogene Suspensionen zu erhalten.
   2. Homogenisieren Sie die bakteriellen Suspensionen mit einer 26-G-Nadel (15 Auf-und-Ab-Sequenzen), sonisieren Sie dreimal für 10 Sekunden (mit 10 Sekunden Pausen zwischen den Sonikationssequenzen) mit einem Wasserbad-Sonikator. Fügen Sie 1 ml 7H9OADc/T hinzu und wirbeln kurzzeitig vor. Zentrifugiere 3 Minuten bei 100 x g.
   3. Sammeln Sie vorsichtig die mykobakterienhaltigen Supernatanten ein, um Klumpen zu vermeiden, und sammeln Sie die homogenen Suspensionen in einem 50 ml sterilen Kunststoffrohr.
   4. Überprüfen Sie visuell auf das Vorhandensein der eventuellen verbleibenden bakteriellen Aggregate.
      HINWEIS: Wenn noch Zuschlagstoffe vorhanden sind, wird für 2 Minuten ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt bei 100 x g durchgeführt und das Überlagerungsmittel gesammelt.
   5. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 4.000 x g für 5 Minuten, suspendieren Sie das Pellet in 200 μl 7H9OADc/T und fahren Sie mit der Injektion fort.
   6. Bewerten Sie die endgültige Bakterienkonzentration durch das Auftragen von seriellen Verdünnungen (in 1x PBST) auf 7H10OADc-Agar und das Zählen der koloniebildenden Einheiten (CFU) nach 4 Tagen Inkubation bei 30 °C. CFUs sollten für jede neue Charge bestimmt werden.
   7. Bereiten Sie gefrorene Inokulabestände vor, indem Sie 5 μl Aliquot bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Die CFU-Bewertung der gefrorenen Aliquoten von -80°C ist Voraussetzung, um die genaue Anzahl lebensfähiger Bakterien zu bestimmen, da Einfrieren/Auftauen die bakterielle Lebensfähigkeit des Inokulums beeinträchtigen kann. Diese gefrorenen Inokula sind bereit für die späteren Injektionen. Da alle Aliquots die gleiche Anzahl an CFU enthalten, ermöglichen sie die Injektion von Bakterien auf reproduzierbare Weise von einem Experiment zum nächsten.
3. Qualitätskontrolle des Inokulums
   HINWEIS: Die Ziehl-Neelsen-Färbung (spezifisch für Mykobakterien) kann verwendet werden, um die Qualität der bakteriellen Suspensionen vor und nach den Homogenisierungsverfahren zu vergleichen.
   1. Entdecken und verteilen Sie einen Tropfen der homogenisierten bakteriellen Suspension auf einem Glasträger und lassen Sie ihn vollständig trocknen. Den Schmier mindestens 30 Minuten auf einer auf 65-70 °C eingestellten Heizplatte korrigieren und mit einem Ziehl-Neelsen-Färbungsprotokoll beizieren.
   2. Beobachten Sie den bakteriellen Abstrich mit einem Mikroskop mit einem 100-fachen Objektiv und vergleichen Sie ihn mit einem Abstrich einer nicht verarbeiteten bakteriellen Suspension (Abbildung 1).

2. Zebrafisch-Embryonen zubereiten

1. Laichen und Zebrafischeier sammeln
   1. Am Tag vor dem Laichen züchten Sie erwachsene Zebrafische, indem Sie 2 Männchen und 1 Weibchen (meist ein Verhältnis von 2:1 ermöglicht eine optimale Befruchtungsrate) in eine Brutkammer setzen, die aus einem separaten Aquarium mit einem Eiersammelkorb besteht.
      HINWEIS: Eisammelkörbe werden verwendet, um die Eier vor dem Verzehr durch die Eltern zu schützen und die Eierernte zu erleichtern.
   2. Bei 1 hpf werden Eier und nur richtig entwickelte Embryonen in einer 100 mm großen Petrischale mit 25 ml blauem Fischwasser (maximal 100 Embryonen pro Schaal) geerntet und bei 28,5 °C gelagert. Nicht befruchtete Eier werden entsorgt.
2. Vorbereitung von Zebrafisch-Embryonen für Injektionen
   1. Etwa 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) dechorionieren Sie die Embryonen mit feinen Pinzetten in einer 100 mm großen Petrischale und halten Sie sie bei 28,5 °C.
   2. Sammeln Sie die 30-48 HPF-Embryonen mit einer Pipette und übertragen Sie sie in eine "V"-förmige Positionierungskammer, die mit 25 ml Fischwasser und 270 mg/L Tricain gefüllt ist. Legen Sie die Embryonen richtig in die Kanäle mit einem selbstgebauten Microloader-Tip-Tool (einer selbstgemachten abgeschnittenen Microloader-Spitze), das für eine einfachere Mikromanipulation optimiert ist.
      HINWEIS: Orientieren Sie die dorsale Seite nach unten für intravenöse Injektionen in der Kaudalvene oder die dorsale Seite nach oben für Schwanzmuskelinjektionen.

3. Mikroinjektionsverfahren

HINWEIS: Um die Chronologie der M. abscessus-Infektion (Überleben, Bakterienbelastung, Kinetik und Infektionsmerkmale) zu bewerten, werden Injektionen in die Kaudalvene von 30 HPF-Embryonen bevorzugt. Um die Rekrutierung von Immunzellen zu visualisieren, werden Injektionen an lokalisierten Stellen durchgeführt, wie etwa in den Schwanzmuskeln eines 48-HPF-Embryos.

1. Verdünnen Sie das mykobakterielle Inokulum mit 1X PBST (abhängig von der Anzahl der zu verabreichenden CFU), das 10 % rotes Phenol enthält, um die korrekte Injektion zu überprüfen.
2. Laden Sie eine Mikrokapillarinjektionsnadel mit 5–10 μl des bakteriellen Inokulums mit einer Microloader-Spitze, verbinde die Mikroinjektionsnadel mit dem Halter des dreidimensionalen Mikromanipulators am Injektor und brich mit einer feinen Pinzette die Nadeloberseite ab, um einen Öffnungsdurchmesser von 5–10 μm zu erhalten.
3. Kalibrieren Sie das Einspritzvolumen, indem Sie den Mikroinjektionsdruck (20–50 hPa) und die Zeit (0,2 Sekunden) anpassen.
   HINWEIS: Das erforderliche Injektionsvolumen wird durch visuelle Bestimmung des Durchmessers eines in das Eigelb eines Embryos ausgestoßenen Tropfens kalibriert.
4. Für die Injektion der Kaudalvene positionieren Sie den Embryo so, dass die ventrale Seite zur Nadel zeigt, und die Nadelspitze nahe an die urogenitale Öffnung, wobei die Kaudalvene angerichtet ist, und die Nadelspitze vorsichtig in den Embryo drückt, bis sie gerade den Bereich der Kaudalvene durchsticht. Geben Sie das gewünschte Volumen bakterieller Präparation ab, üblicherweise 1–3 nl mit etwa 100 CFU/nl.
5. Für die intramuskuläre Injektion wird der Embryo so positioniert, dass die dorsale Seite zur Nadel zeigt, die Nadel über einen Somit gelegt und ein kleines Volumen (1 nl) Inokulum injiziert.
   HINWEIS: Was die Kaudalvenen-Injektionen betrifft, so sind auch intramuskuläre Injektionen schwierig durchzuführen. Es muss darauf geachtet werden, Überlastungen zu vermeiden, die das umliegende Gewebe schädigen können.
6. Am Ende des Injektionsverfahrens wird die Größe des Inokulums kontrolliert, indem man das gleiche Volumen bakterieller Suspension in einen Tropfen sterilen PBST injiziert, anschließend auf 7H10 OADc plattiert und die CFU zählt. Etwa 100 Embryonen können mit einer Nadel injiziert werden.
   HINWEIS: Da sich ein grober M. abszessus weiterhin in der Nadel anschließen kann, müssen Injektionen unmittelbar nach der Vorbereitung des Inokulums erfolgen.
7. Übertragen Sie die infizierten Fische einzeln auf 24-Brunnenplatten mit 2 ml/Brunnen Fischwasser und inkubieren Sie bei 28,5 °C. Embryonen, die mit 1-3 nl 1x PBS injiziert werden, können als Kontrolle verwendet werden.
8. Eine ordnungsgemäße Infektion fluoreszierender Bakterien in Embryonen wird mit einem Fluoreszenzmikroskop überwacht.

4. Quantifizierung der bakteriellen Belastung

1. Bestimmung durch CFU-Enumeration
   1. Zum gewünschten Zeitpunkt werden Gruppen infizierter Embryonen (5 pro Erkrankung) in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (1 Embryo/Tube) aufgenommen, die Embryonen durch 10 Minuten auf Eis inkubiert und mit einer Überdosis Trikain (300–500 mg/L) eingeschläfert
   2. Waschen Sie die Embryonen zweimal mit sterilem Wasser und geben Sie sie in einem neuen Schlauch. Jeden Embryo mit 2 % Triton X-100, verdünnt in 1x PBST, mit einer 26-G-Nadel und homogenisieren Sie die Suspension bis zur vollständigen Lyse. Zentrifugiere die Federung und suspendiere das Pellet in 1X PBST mit 0,05 % Tween 80. Serielle Verdünnungen der Homogenate werden auf Middlebrook 7H10OADc verschichtet und mit BBL mgit panta ergänzt, wie vom Anbieter empfohlen.
      HINWEIS: M. abszess ist anfälliger für die NaOH-Behandlung als M. marinum. Die Dekontamination von Fischlysaten ohne Beeinträchtigung des Wachstums von M. abscessus kann erfolgreich mit dem Antibiotikacocktail BBL MGIT PANTA erreicht werden.
   3. Die Platten 4 Tage lang bei 30 °C inkubieren und die Kolonien zählen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Präparation von dispersierten M. abscessus inocula. Ziehl-Neelsen-Färbung von R- oder S-Varianten, die auf Brühemedium vor jeder Behandlung (obere Paneele) oder nach der Behandlung (untere Paneele) a...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BBL MGIT PANTA	BD Biosciences	245114
Rinderserum-Albumin	Euromedex	04-100-811-E
Catalase von Bovine Liver	Sigma-Aldrich	C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar	BD Biosciences	262710
Difco Middlebrook 7H9 Brühe	BD Biosciences	271310
Ethyl-3-Aminobenzoat-Methanesulfonatsalz (Tricain)	Sigma-Aldrich	A5040
Ölsäure	Sigma-Aldrich	O1008
Paraformaldehyd	Delta-Mikroskopie	15710
Phenolrot	Sigma-Aldrich	319244
Tween 80	Sigma-Aldrich	P4780
Agar	Gibco Life Technologie	30391-023
Agarose mit niedrigem Schmelzen	Sigma-Aldrich
Sofortiges Ozeanmeersalz	Aquarium Systems Inc
Kapillaren aus Borosilikatglas,	Sutter Instrument Inc.	BF100-78-10	1 mm O.D. X 0,78 mm I.D.
Mikropipettenziehgerät	Sutter Instrument Inc.		Flammende/Brauner Mikropipettenzieher P-87
Mikroinjektor	Tritech-Forschung		Digitaler microINJECTOR, MINJ-D
Pinzette	Sciences Tools inc		Dumont # M5S
Microloader-Spitzen	Eppendorf