Modellierung der Aeromonas-Pathogenese bei C. elegans mit einem Überlebenstest

Zusammenfassung

Quelle: Chen, Y., et al. Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas-Infektion in einem Caenorhabditis elegans-Modell . J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert einen Überlebenstest mit C. elegans , um die Pathogenese von Aeromonas zu modellieren, bei der die orale Aufnahme der Bakterien zu Darminfektionen und Sterblichkeit führt und so eine quantitative Bewertung der bakteriellen Virulenz in einem lebenden Wirtssystem ermöglicht.

Protokoll

1. C. elegans Überlebenstest mit Aeromonas

1. Am Tag der Aussäung von L1-Würmern auf dem ENGM (angereicherten Nematodenwachstumsmedium), das sich mit E. coli OP50 ausbreitet, wählen Sie jeweils eine einzelne Kolonie jeder der vier Aeromonas-Stämme oder E. coli OP50 und kultivieren Sie mit 2 ml LB-Brühe bei 37 °C für 16 Stunden.
   HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, sollte dieser Schritt in einer laminaren Flusshaube durchgeführt werden. Hier wurden folgende Bakterienstämme verwendet: E. coli OP50, die normale Nahrungsquelle von C. elegans. A. dhakensis AAK1, das erste vollständig sequenzierte pathogene klinische A. dhakensis-Isolat . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 und A. caviae A2-9307121 sind repräsentative klinische Isolate des National Cheng Kung University Hospital.
2. Misse die Absorption von bakterieller Brühe mit OD₆₀₀ (optische Dichte bei 600 nm) und passe die Brühe mit LB-Brühe auf OD₆₀₀ = 2,0 an.
3. Spotte und verteile 30 μL Bakterienbrühe auf jede 6 cm lange NGM-Platte (Nematodenwachstumsmedium). Die Teller über Nacht bei Zimmertemperatur kultivieren.
   HINWEIS: Zur Herstellung von NGM lösen Sie 3 g NaCl (Natriumchlorid), 2,5 g bakterielles Pepton und 20 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser. Autoklav bei 121 °C für 20 Minuten. Warte, bis es auf 55 °C in einem Wasserbad abgekühlt ist, und gib dann 1 ml 1 M CaCl₂ (Calciumchlorid), 1 ml 1 M MgSO₄ (Magnesiumsulfat), 1 ml 5 % Cholesterin in Ethanol und 25 ml Phosphatpuffer hinzu. Wirbeln, um gut zu mischen.
4. Am Tag, an dem die L1-Würmer auf das L4-Stadium heranwachsen, pflücken und übertragen sie zufällig 50 Würmer auf eine NGM-Platte mit jedem der vier Aeromonas-Stämme oder E. coli OP50.
5. Inkubieren Sie die NGM-Platten bei 20 °C, bis der Test abgeschlossen ist.
6. Übertragen Sie alle lebenden Würmer auf eine neu vorbereitete NGM-Platte mit Bakterien und zählen Sie täglich die Anzahl der lebenden, toten und sensorischen Würmer, bis der letzte Wurm tot ist.
   HINWEIS: Übertragen Sie die Würmer täglich auf eine frisch vorbereitete NGM-Platte zur Aufrechterhaltung der Infektion, selbst bei sterilen Würmern (z. B. GLP-4 oder mit FudR).
7. Plotten Sie die Überlebenskurven basierend auf der täglichen Datenberechnung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Shaker-Brutkasten	YIH DER	LM-570R	Bakterieninkubation
NaCl	SIGMA	31434	Zubereitung von Kulturmedium
MgSO₄	SIGMA	M7506	Zubereitung von Kulturmedium
Agar	Difco	214530	Zubereitung von Kulturmedium
CaCl₂	SIGMA	C1016	Zubereitung von Kulturmedium
Cholesterin	SIGMA	C8503	Zubereitung von Kulturmedium
6 cm Petriplatte	ALPHA PLUS	46	Vorbereitung der Agarplatte
Bakterielles Pepton	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Zubereitung von Kulturmedium
FudR	SIGMA	1271008	Zubereitung von Kulturmedium
Mikroskopsystem	Nikon	Eclipase Ti invertiert	Mikroskopische Bildgebung