Bewertung der bakteriellen Virulenz mit dem C. elegans Liquid Toxicity Assay

Abstract

Quelle: Chen, Y., et al. Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas-Infektion in einem Caenorhabditis elegans-Modell. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert den C. elegans Liquid Toxicity Assay mit Aeromonas, eine Methode zur Bewertung bakterieller Virulenz durch Messung des Überlebens von Würmern in einer nährstoffarmen flüssigen Umgebung. Der Test zeigt stammspezifische Pathogenität anhand des Ausmaßes der durch Toxinen verursachten Schäden und Sterblichkeit bei C. elegans.

Protocol

1. C. elegans Liquid Toxicity Assay mit Aeromonas

HINWEIS: Um eine Verunreinigung zu vermeiden, sollten Schritte in einer laminaren Flusshaube durchgeführt werden.

1. Am Tag nach dem Aussäen der L1-Würmer auf der ENGM (Enriched nematode growth medium) Platte, verteilt mit E. coli OP50, nehmen Sie jeweils eine einzelne Kolonie jeder der vier Aeromonas-Stämme und E. coli OP50 und kultivieren Sie mit jeweils 5 ml LB-Brühe bei 37 °C für 16 Stunden.
   HINWEIS: Im Protokoll wurden folgende Bakterienstämme verwendet: E. coli OP50, die normale Nahrungsquelle von C. elegans. A. dhakensis AAK1, das erste vollständig sequenzierte pathogene klinische A. dhakensis-Isolat . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 und A. caviae A2-9307121 sind repräsentativ klinische Isolate des National Cheng Kung University Hospital.  
   HINWEIS: Zur Herstellung eines angereicherten NGM (ENGM) lösen Sie 3 g NaCl, 5 g bakterielles Pepton, 1 g Hefeextrakt und 30 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser. Autoklav bei 121 °C für 20 Minuten. Warte, bis es auf 55 °C in einem Wasserbad abgekühlt ist, und gib 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M MgSO₄, 1 ml 5 % Cholesterin in Ethanol und 25 ml Phosphatpuffer hinzu. Wirbeln, um gut zu mischen.
2. Misse die Absorption von OD₆₀₀ der Bakterienbrühe.
3. Zentrifugiere die bakterielle Brühe bei 3.500 x g für 15 Minuten, um die LB-Brühe zu entfernen. Die Bakterien wieder suspendieren und die Bakterienbrühe mit S-Medium auf OD₆₀₀ = 3,0 anpassen. Fügen Sie 195 μL bakterielle Brühe in S-Medium zu mindestens 8 Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu.
   HINWEIS: Die Zusammensetzung des S-Mediums: Zur Herstellung eines S-Mediums wird vor der Anwendung 40 mL S-Basal, 0,4 ml 1 M Kaliumcitrat, 0,4 ml Spurmetalllösung, 0,12 ml 1 M CaCl₂, 0,12 ml 1 M MgSO₄, 40 μL 5 % Cholesterin in Ethanol und 1 ml 8 mM FudR vor der Verwendung gemischt.
4. Waschen Sie die L4-Würmer auf der ENGM-Platte mit E. coli OP5 mit M9-Medium ab. Stellen Sie die Schneckenlösung auf eine Konzentration von 5 Würmern pro μL ein und geben Sie 5 μL der Wurmlösung zu jedem Brunnen der 96-Bohrloch-Platte. Stellen Sie sicher, dass es etwa 25 Würmer pro Brunnen gibt.
5. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte auf einem Shaker bei 200 U/min bei 25 °C.
6. Zähle die Anzahl der lebenden und toten Würmer nach 24, 48 und 72 Stunden. Berechnen Sie die Überlebensraten jedes Bohrlochs mit folgender Formel: (Lebende Würmer/Gesamtwürmer) × 100%.
7. Zeichne ein Streudiagramm mit der täglichen Datenberechnung.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker-Brutkasten	YIH DER	LM-570R	Bakterieninkubation
NaCl	SIGMA	31434	Zubereitung von Kulturmedium
MgSO₄	SIGMA	M7506	Zubereitung von Kulturmedium
Agar	Difco	214530	Zubereitung von Kulturmedium
CaCl₂	SIGMA	C1016	Zubereitung von Kulturmedium
Cholesterin	SIGMA	C8503	Zubereitung von Kulturmedium
Ethanol	SIGMA	32205	Zubereitung von Kulturmedium
KOH	SIGMA	P5958	Zubereitung von Kulturmedium
6 cm Petriplatte	ALPHA PLUS	46	Agarplatten-Vorbereitung
96-Well-Platte	FALCON	353072	Flüssigkeitstest
Bakterielles Pepton	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Zubereitung von Kulturmedium
Hefeextrakt	SIGMA	92144	Zubereitung von Kulturmedium
Zitronensäure•H₂O	SIGMA	Um 1909	Zubereitung von Kulturmedium
Tri-Kaliumcitrat•H₂O	SIGMA	104956	Zubereitung von Kulturmedium
FudR	SIGMA	1271008	Zubereitung von Kulturmedium
Dinatrium EDTA	SIGMA	E1644	Zubereitung von Kulturmedium
Trypton	SIGMA	16922	Zubereitung von Kulturmedium
Mikroskopsystem	Nikon	Eclipase Ti invertiert	Mikroskopbildgebung
Wissenschaftliche CCD-Kamera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Mikroskopbildgebung