Muskelnekrose-Test bei C. elegans, induziert durch einen pathogenen Aeromonas-Stamm

Zusammenfassung

Quelle: Chen, Y. et al., Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas-Infektion in einem Caenorhabditis elegans-Modell . J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt einen Muskelnekrose-Test bei C. elegans (Caenorhabditis elegans) unter Verwendung pathogener Aeromonas-Stämme . Durch die Fütterung von grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP)-exprimierenden Würmern auf Aeromonas-Samenplatten modelliert der Test bakterielle Infektionen und zeigt Gewebeschäden durch fluoreszenzbildende Bildgebung. Der fortschreitende Verlust von Muskelstruktur und GFP-Signal deutet auf eine durch Aeromonas induzierte nekrotische Reaktion hin.

Protokoll

1. Caenorhabditis elegans Muskelnekrose-Assay mit Aeromonas

HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, sollten diese Schritte in einer laminaren Flusshaube durchgeführt werden.

1. Am Tag der Aussäung der L1-Würmer auf dem angereicherten Nematodenwachstumsmedium (ENGM), das mit Escherichia coli OP50 ausgebreitet ist, nehmen Sie jeweils eine einzelne Kolonie jeder der vier Aeromonas-Stämme und E. coli OP50 und kultivieren Sie mit jeweils 2 ml Luria-Bertani (LB) Brühe bei 37 °C für 16 Stunden. HINWEIS: Hier wurden folgende Bakterienstämme verwendet: E. coli OP50, die normale Nahrungsquelle von C. elegans. A. dhakensis AAK1, das erste vollständig sequenzierte pathogene klinische A. dhakensis-Isolat . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 und A. caviae A2-9307121 sind repräsentative klinische Isolate des National Cheng Kung University Hospital.
2. Misse die_{OD-600-Absorption} der Bakterienbrühe und passe die Brühe mit LB-Brühe auf OD₆₀₀ = 2,0 an. Spott und verteilt 30 μL bakterielle Brühe auf 6 cm lange Nematodenwachstumsmediumplatten (NGM). Die Teller über Nacht bei Zimmertemperatur kultivieren.
3. Am Tag, an dem die L1-Würmer das L4-Stadium erreichen, übertragen sie 50 Würmer auf jede NGM-Platte mit jedem der vier Aeromonas-Stämme oder E. coli OP50. Inkubieren Sie die NGM-Platten bei 20 °C. Übertragen Sie die Würmer alle 24 Stunden auf neu vorbereitete NGM-Platten mit Bakterien.
4. Machen Sie Muskelaufnahmen mit einem Fluoreszenzmikroskop.
   1. Nimm zufällig 10 Würmer auf ein 2%iges Agarose-Gel in M9-Medium auf einem Objektträger. Lähme die Würmer mit 2 μL 1% Natriumazid in M9-Medium auf Agarose für weniger als 5 Minuten vor der Aufnahme.
   2. Legen Sie einen Deckungszettel an und nehmen Sie die Muskelbilder mit einem grünen fluoreszierenden Proteinfilter (GFP) auf einem Leuchtstoffmikroskop mit ladungsgekoppelter Gerätekamera auf. Nehmen Sie die Muskelbilder 24, 48 und 72 Stunden nach der L4-Stufe auf.

Führen Sie Bildanalysen und Figurenvorbereitungen mit einer Bildverarbeitungssoftware durch.
HINWEIS: Die Definitionen der Werte und der Muskelschadensgrade sind in Abbildung 1 dargestellt, wobei die Kriterien wie folgt aufgeführt sind: 3 Punkte für fehlende Muskelfasern; 2 Punkte für gerissene oder gebrochene Muskelfasern; 1 Punkt für verbogene Muskelfasern; 0 Punkte für gesunde Muskelfasern.

Ergebnisse

Abbildung 1: Die entsprechenden Werte für Muskelnekrose bei C. elegans, ausgelöst durch eine Aeromonas-Infektion. Die Kriterien für Muskelnekrose und entsprechende Werte ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Shaker-Brutkasten	YIH DER	LM-570R	Bakterieninkubation
K₂HPO₄	J.T. Baker	MP021519455	Zubereitung von Kulturmedium
KH₂PO₄	J.T. Baker	3246-05	Zubereitung von Kulturmedium
Na₂HPO₄	J.T. Baker	MP021914405	Zubereitung von Kulturmedium
NaCl	SIGMA	31434	Zubereitung von Kulturmedium
MgSO₄	SIGMA	M7506	Zubereitung von Kulturmedium
Agar	Difco	214530	Zubereitung von Kulturmedium
CaCl₂	SIGMA	C1016	Zubereitung von Kulturmedium
Cholesterin	SIGMA	C8503	Zubereitung von Kulturmedium
Ethanol	SIGMA	32205	Zubereitung von Kulturmedium
KOH	SIGMA	P5958	Zubereitung von Kulturmedium
6 cm Petriplatte	ALPHA PLUS	46	Vorbereitung der Agarplatte
Bakterielles Pepton	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Zubereitung von Kulturmedium
Hefeextrakt	SIGMA	92144	Zubereitung von Kulturmedium
Zitronensäure•H₂O	SIGMA	Um 1909	Zubereitung von Kulturmedium
Tri-Kaliumcitrat•H₂O	SIGMA	104956	Zubereitung von Kulturmedium
FudR	SIGMA	1271008	Zubereitung von Kulturmedium
Dinatrium EDTA	SIGMA	E1644	Zubereitung von Kulturmedium
FeSO₄·7H₂O	SIGMA	215422	Zubereitung von Kulturmedium
MnCl₂·4H₂O	SIGMA	221279	Zubereitung von Kulturmedium
ZnSO₄·7H₂O	SIGMA	204986	Zubereitung von Kulturmedium
CuSO₄·5H₂O	SIGMA	C8027	Zubereitung von Kulturmedium
Trypton	SIGMA	16922	Zubereitung von Kulturmedium
Mikroskopsystem	Nikon	Eclipase Ti invertiert	Mikroskopische Bildgebung
Wissenschaftliche CCD-Kamera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Mikroskopische Bildgebung