Curli-faservermittelte Stabilisierung bakterieller Hydrogelmuster

Zusammenfassung

Quelle: Spiesz, E. M. et al., Dreidimensionales Mustern von Engineered Biofilms mit einem Do-it-yourself-Bioprinter. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert eine Methode zum Vergleich von 3D-gedruckten Alginatmustern, die entweder Kontroll- oder gentechnisch veränderte Bakterienstämme enthalten. Der Teststamm bildet bei der Induktion Curli-Fasern, die die Alginat-Hydrogelstruktur verstärken. Nach der Behandlung mit einer calcium-chelierenden Lösung bleibt nur das Testmuster erhalten, was die stabilisierende Wirkung der Curli-Faserproduktion hervorhebt.

Protokoll

1. 3D Druckverfahren

1. Installieren und öffnen Sie die 3D-Drucksoftware (Table of Materials) auf einem Computer. Verbinde den 3D-Drucker mit dem Computer. Bewegen Sie den Druckkopf an seine Home-Position, indem Sie auf die Home-Taste für die X-, Y- und Z-Achsen klicken.
2. Für jeden Druck wird ein vorbereitetes Drucksubstrat an eine bestimmte Stelle auf dem Druckbett platziert.
3. Kalibrieren Sie die Höhe des Druckkopfes in der Z-Achse.
   1. Heben Sie den Druckkopf manuell auf eine Höhe von 22 mm, damit er beim Bewegen in die gewünschte Position nicht mit dem Rand der Petrischalbe kollidiert. Positioniere den Druckkopf über der Platte und bewege ihn nach unten, bis die Pipettspitze die Druckfläche berührt. Weise diese Z-Achsenposition als Z1 (die Höhe der Druckfläche) zu.
   2. Heben Sie den Druckkopf an und bewegen Sie ihn manuell außerhalb des Plattenbereichs auf den X-, Y- und Z-Achsen. Wenn der Arbeitsabstand zwischen Druckkopf und Plattenoberfläche als Z2 definiert ist, geben Sie Z1 + Z2 während des Drucks als Z-Wert in das Druckprogramm ein.
4. Programmieren Sie die Druckform mit einer selbst entwickelten, punkt-für-punkt-koordinatenbestimmten Methode entsprechend der gewünschten Flugbahn.
   1. Wenn die gewünschte Flugbahn eine gerade Linie ist, definieren Sie nur den Start- und Endpunkt. Das Einfügen zusätzlicher Punkte auf gekrümmten Linien führt zu glatteren Kurven. Bewegen Sie den Druckkopf manuell zu jedem Punkt nacheinander und notieren Sie die Koordinaten dieser Punkte in der richtigen Reihenfolge. Geben Sie alle diese Koordinaten sowie die Bewegungsgeschwindigkeit des Druckkopfes für jedes gedruckte Segment in den G-Code-Editor ein.
5. Sowohl vor als auch nach dem Druck heben Sie den Druckkopf auf einen Abstand höher als die Plattenkante (20 mm) und bewegen Sie sich direkt aus dem Plattenbereich heraus. Speichern Sie dieses Programm als G-Code-Datei und laden Sie direkt für die Verwendung in nachfolgenden Drucken, während Sie die Z-Achsenhöhe für jedes neue Drucksubstrat neu messen.
   HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für ein Beispiel für einen G-Code zum Drucken eines Quadrats.
6. Lade die vorprogrammierte G-Code-Datei. Öffnen Sie den G-Code-Editor in der Software und programmieren Sie die Befehle zum Drucken der gewünschten Form. An jeder Befehlszeile kann die Position des Druckkopfs in der X-, Y- und/oder Z-Achse geändert werden. Geben Sie den Z-Wert während aller Druckschritte als Z1 + Z2 (Höhe der Druckfläche + Arbeitsabstand) ein.
   HINWEIS: Die Bewegungsgeschwindigkeit ist ebenfalls einstellbar; 9.000 mm/min ist ein geeigneter Wert für typische Druckraten.
7. Fülle die flüssige Bio-Tinte in Spritzen und montiere sie in die Spritzenpumpe des 3D-Bioprinters.
8. Drucken Sie die Bio-Tinte auf das Drucksubstrat, indem Sie auf die Schaltfläche "Drucken" klicken.
9. Während des Drucks steuern Sie die Bewegung des Druckkopfs vollständig mit der Software. Starte die Spritzenpumpe manuell, bevor der Druckkopf Kontakt mit der Druckfläche hat.
   HINWEIS: Die Koordination der Spritzenpumpe und des Druckers wird empirisch abhängig von der Extrusionsgeschwindigkeit, der Geschwindigkeit, mit der sich der Druckkopf zum ersten Druckpunkt bewegt, und der Anfangsposition des Druckkopfes. Wenn die Anfangsposition des Druckkopfs 20 mm beträgt, mit einer Druckkopfgeschwindigkeit von 9.000 mm/min und einer Extrusionsgeschwindigkeit von 0,1 mL/h, starten Sie die Spritzenpumpe sofort nach Druckbeginn. Wenn die Extrusionsgeschwindigkeit von 0,1 mL/h auf 0,3 mL/h geändert wird, warten Sie 2−3 Sekunden, um die Spritzenpumpe nach dem Druckstart zu starten.
10. Stoppen Sie die Spritzpumpe, sobald der Druckkopf am letzten Druckpunkt ankommt. Stoppen Sie die Spritzenpumpe, bevor der Druckkopf am Ende des Druckvorgangs angehoben wird, sonst fällt überschüssige Bio-Tinte auf das Drucksubstrat und verringert die Druckauflösung.
11. Für den Aufbau von 3D-Strukturen steuern Sie alle Bewegungen des Druckkopfs im G-Code-Editor. Geben Sie die Druckgröße der ersten Schicht ein. Erhöhen Sie den Z-Wert im G-Code um 0,2 Millimeter für die zweite Schicht, um die Druckhöhe zu erhöhen. Erhöhe anschließend den Z-Wert um 0,1 Millimeter, wenn du auf eine höhere Schicht wechselst. Bewegen Sie die Platte während des Druckvorgangs nicht.
12. Um die Breite und Höhe des bedruckten Hydrogels zu messen, verwenden Sie ein Stahllineal, das unter oder neben der Probe platziert wird.

2. Anbau und Prüfung der Wirksamkeit der Biofilmproduktion durch E. coli

1. Inkubieren Sie die gedruckten Proben bei Raumtemperatur für 3−6 Tage, um die Herstellung von Biofilmkomponenten (Curli-Fasern) zu ermöglichen. Fotografieren Sie die Platten mit einer Kamera oder einem Leuchtstoffstoffscanner.
2. Um die Alginatmatrix aufzulösen, fügen Sie 20 ml 0,5 m Natriumcitratlösung (pH = 7, angepasst mit NaOH) zu den Drucksubstraten und inkubieren Sie 2 Stunden mit 30 U/min Schütteln bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und bilden Sie die Platten erneut ab, um sie mit den Bildern der Platten vor der Citratbehandlung zu vergleichen.

Tabelle 1: Programmierprozess und Erklärungen des G-Code zum Drucken eines Quadrats.

G-Code-Befehle	Aufgaben
G1 Z20 F9000	Heben Sie die Z-Achse auf eine Höhe von 20 mm mit einer Bewegungsgeschwindigkeit von 9.000 mm/min.
G1 X95 Y65 F9000	Bewege dich zum Startpunkt der ersten Linie mit einer Bewegungsgeschwindigkeit von 9.000 mm/min.
G1 Z6 F9000	Bewege dich in Z-Richtung nach unten zu einer angemessenen (hier Z = 6 mm) Druckdistanz.
G1 X95 Y105 F300	Endpunkt der ersten Zeile und Startpunkt der zweiten Linie.
G1 X135 Y105	Endpunkt der zweiten Zeile und Startpunkt der dritten Linie.
G1 X135 Y65	Endpunkt der dritten Linie und Startpunkt der vierten Linie.
G1 X95 Y65	Endpunkt der vierten Zeile und Ausgangspunkt der ersten Zeile; Ein Quadrat wird gebildet.
G1 Z20 F9000	Heben Sie die Z-Achse auf eine Höhe von 20 mm bei 9.000 mm/min.
G1 X55 Y40 F9000	Bewege dich zu einer Koordinate (55, 40) außerhalb des Petrischalenbereichs.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
LB-Brühepulver	Sigma-Aldrich	L3022
Orbitalshaker	VWR	89032-092	Modell 3500
Petrischale	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Siliziumrohr	VWR	DENE 3100103/25
Spritzenpumpe	ProSense B.V.	NE-300
Natriumalginat	Sigma-Aldrich	W201502
Natriumcitrat monobasisch	Sigma-Aldrich	71498
Natriumhydroxid	VWR	28244.295