Untersuchung der mikrobiellen Aktivität des menschlichen Darms an Exopolysaccharide

Zusammenfassung

Quelle: Hu, Y. et.al., Analyse der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota mittels In-vitro-Badefermentationssystemen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert die Analyse der kurzkettigen Fettsäureproduktion durch die menschliche Darmmikrobiota als Reaktion auf Exopolysaccharide. Dies unterstreicht die Trennung und Quantifizierung mikrobieller Fermentationsprodukte mittels Gaschromatographie. Die Ergebnisse zeigen, dass Exopolysaccharide mikrobielle Metabolite modulieren, die die Dynamik von Wirt und Erreger im Darm beeinflussen.

Protokoll

1. Auswirkungen von Exopolysaccharid (EPS) auf die Produktion von kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) durch die menschliche Darmmikrobiota
   1. Fügen Sie fermentierte Übersupernatanten (1 ml) hinzu, die in Schritt 5,3 bis 2 ml Zentrifugenröhren hergestellt werden.
   2. Fügen Sie 0,2 ml 25 % (w/v) Metaphosphorsäure zu jeder Proben hinzu und mischen Sie die Lösungen gründlich durch Vortexen.
   3. Zentrifugieren Sie die Gemische bei 13.000 x g für 20 Minuten und übertragen Sie die Übernatalanten in frische Rohre.
   4. Gleichzeitig werden Lösungen aus 120 mM Essigsäure, Propionsäure, Butyrsäure, Isobutyrinsäure, Baldrsäure und Isovalersäure hergestellt. Dann geben Sie 1 ml jeder vorbereiteten Säure zu 1,2 ml 25 % (mit v) Metaphosphorsäure und verwenden Sie sie als Standardcocktails.
   5. Filtern Sie die Proben mit einer 0,22 μM-Membran.
   6. Erkennen Sie SCFA-Konzentrationen mittels Hochleistungsgaschromatographie.
      HINWEIS: Eine InertCap-FFAP-Säule (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM) wird für die Gaschromatographie (GC) verwendet. Die SCFA-Konzentrationen werden dann anhand von Spitzenflächen mit der Einpunkt-internen Standardmethode im Softwarepaket GC Solution quantifiziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 μm-Membranfilter	Millipore	SLGP033RB	Verwendung zum Filtern von Samples
0,4-mm-Sieb	Thermo Fischer	308080-99-1	Verwendung zur Herstellung menschlicher Stuhlproben
Essigsäure	Sigma-Aldrich	71251	Standardstichprobe für SCFA
Butyric	Sigma-Aldrich	19215	Standardstichprobe für SCFA
Kapillarsäule	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0,25 mm × 30 m × 0,25 μm)	Verwendung zur SCFA-Erkennung
Gaschromatographie	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Verwendung zur SCFA-Erkennung
Isobutterisch	Sigma-Aldrich	46935-U	Standardstichprobe für SCFA
Isovalerinsäuren	Sigma-Aldrich	129542	Standardstichprobe für SCFA
Metaphosphorsäure	Sigma-Aldrich	B7350	Standardstichprobe für SCFA
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Basislösung zur Anpassung des pH-Werts der Puffer
Propionisch	Sigma-Aldrich	94425	Standardstichprobe für SCFA
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Standardstichprobe für SCFA