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1. Mikroskop-Aufbau und Zeitraffer-Erfassung
HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll wurde für ein invertiertes Weitfeldmikroskop mit Autofokus, ein 100X/1,30 NA-Öl-PH3-Objektiv, eine X, Y-motorisierte Stufe, eine sCMOS-Kamera, eine Lichtquelle, Filter für grün-fluoreszierende, rot-fluoreszierende oder gelb-fluoreszierende Proteine sowie eine temperaturkontrollierte Inkubationskammer entwickelt. Diese Kammer schützt die Zellen vor Licht und hält eine konstante Temperatur.
- Vorheizen Sie die Inkubationskammer und das Mikroskop auf 32 °C für ~1 bis 2 Stunden vor Beginn der Mikroskopie.
HINWEIS: Je nach Mikroskop-Setup kann das Erhitzen länger dauern. Vorheizung ist unerlässlich, um Drift zu reduzieren und das Autofokussteuerungssystem zu stabilisieren. - Schalten Sie das Mikroskop ein und starten Sie die Mikroskopsteuerungssoftware. Wählen Sie das richtige Objektiv sowie die passenden Spiegel und Filter aus, um Phasenkontrastbilder sowie Bilder von grün-fluoreszierend-, rot-fluoreszierenden oder gelb-fluoreszierenden Proteinen zu erhalten.
HINWEIS: Ein Mikroskop wird typischerweise mit bevorzugter Software für die Mikroskopsteuerung und Bildaufnahme geliefert. Hier wurde eine kommerziell erhältliche Software (siehe Materialtabelle) zur Steuerung des Mikroskops und der Bildaufnahme verwendet. - Geben Sie einen Tropfen hochwertiges Immersionsöl auf die Objektivlinse und den Boden der Probe, vorab bei 32 °C inkuviert. Stellen Sie das Objektiv an die niedrigstmögliche Z-Position, um Schäden zu vermeiden, wenn die Probe auf die Mikroskopstufe gelegt wird. Stelle den Metallrahmen mit der Probe auf die Mikroskop-Stage, mit der "Lochseite" zum Objektiv hin. Befestigen Sie die Probe sicher im Stufenhalter.
- Konzentriere dich auf die Zellen, indem du die Bühne in Z-Richtung näher zum Ziel bewegst. Bewege die Bühne langsam, wenn das Öl auf der Unterseite der Probe tropft und das Objektivobjektiv Kontakt aufnimmt. Bewegen Sie die Stufe in X/Y-Richtung, bis mehrere einzelne Zellen im Sichtbereich sichtbar sind, wenn sich die Zellen in der Brennebene befinden. Stellen Sie sicher, dass sich mindestens eine fluoreszierende Mikrosphäre im Sichtfeld befindet, um die aufgenommenen Bilder später auszurichten.
HINWEIS: Unter optimalen Bedingungen sollte eine Zelldichte von 15 bis 30 Zellen pro Sichtbereich (2.048 x 2.048 Pixel oder 133,1 x 133,1 μm) erreicht werden. - Öffnen Sie den Multidimensional Acquisition-Assistenten der Mikroskopsteuerungssoftware, um ein Zeitrafferexperiment einzurichten, das es dem Mikroskop ermöglicht, Bilder bei verschiedenen Wellenlängen und Stufenpositionen bei Bedarf aufzunehmen.
- Im Haupt-Tab aktivieren Sie Zeitraffer und Multiple Wellenlängen. Zusätzliche Tabs erscheinen auf der linken Seite des Fensters.
- Klicken Sie auf den Reiter Speichern und wählen Sie Verzeichnis, um einen leeren Ordner auf der Festplatte des Computers auszuwählen und die aufgenommenen Bilder zu speichern. Aktivieren Sie den Inkrement-Basisnamen, falls eine Datei existiert , um sicherzustellen, dass aufeinanderfolgende Datensätze die älteren nicht überschreiben. Gib dem Experiment dann einen Namen mit Datum und dem Stammnamen oder Titel des Experiments.
- Klicken Sie auf den Reiter Zeitraffer , um die Zeitrafferparameter anzupassen. Setze die Dauer auf 24 Stunden und das Zeitintervall auf 20 Minuten. Die Anzahl der Zeitpunkte ändert sich automatisch.
HINWEIS: Das optimale Zeitintervall hängt vom Experiment und der zu analysierenden zellulären Funktion ab. Häufige Bildaufnahmen können zu Photobleaching führen. Daher muss empirisch ein Kompromiss zwischen zeitlicher Auflösung und Photobleaching gefunden werden. Bei einer Verdopplungszeit von 4 bis 6 Stunden können Bilder problemlos im Abstand von 5 Minuten (oder sogar in kürzeren Abständen, falls gewünscht) für die Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen werden. Wenn eine Fluoreszenzmikroskopie über einen Zeitraum von 24 Stunden gewünscht ist, sollten die Bilder im Abstand von etwa 15 bis 30 Minuten aufgenommen werden. - Klicken Sie auf den Reiter Wellenlängen . Wählen Sie die Anzahl der Wellenlängen aus, die für jedes Bild zu jedem Zeitpunkt erfasst werden sollen, indem Sie die Anzahl ändern.
HINWEIS: Für jede Wellenlänge erscheint auf der linken Seite des Multi-Dimensional Acquisition" -Wizards ein neuer Tab und die Wellenlängen werden in der Reihenfolge von oben nach unten erfasst. Für jede Wellenlänge können die Aufnahmeeinstellungen separat angepasst werden. - Klicken Sie oben auf den ersten Wellenlängen-Tab. Wählen Sie Phasenkontrast in der Beleuchtungs-Dropdown-Liste. Wähle 100 ms für Belichtung und wähle jeden Zeitpunkt in der Dropdown-Liste Erwerben. Deaktiviere automatische Offenlegung, indem du in der Dropdown-Liste 'Niemals' auswählst.
- Wiederholen Sie Schritt 3.5.5 für jede Wellenlänge, die zu jedem Zeitpunkt erfasst werden muss. Für das hier beschriebene experimentelle Setup und fluoreszierend markierte Proteine verwenden Sie folgende Parameter für die Exposition: 250 ms für mCherry-Fusionsproteine, 200 ms für YFP (Yellow fluorescent Protein) Fusionsproteine und 1.000 ms für GFP (Green fluorescent Protein) Fusionsproteine.
HINWEIS: Die optimalen Beleuchtungseinstellungen für jede Stämmung und jedes fluoreszierenden Protein sollten im Voraus bestimmt werden, indem die Lampenintensität und die Bildaufnahmezeit für jede Wellenlänge angepasst werden. Zu lange Bildaufnahmezeiten verstärken den phototoxischen Effekt und führen letztlich zu Wachstumsstillstand und Zelltod. Daher sollte ein Kompromiss zwischen Bildqualität und Zellviabilität eingegangen werden. - Aufnahmen von mehreren Stufenpositionen erfassen, um die Anzahl der im selben Experiment aufgenommenen Zellen zu erhöhen.
- Um Bilder von mehreren Bühnenpositionen zu erhalten, aktivieren Sie im Haupttab Mehrere Bühnenpositionen. Klicken Sie dann auf den Reiter Bühne und klicken Sie auf den Live-Button, um das Sichtfeld zu betrachten.
- Bewegen Sie die Bühne in X/Y-Richtung, bis sich ein Interessensgebiet (ROI) im Sichtfeld befindet. Speichere die X- und Y-Koordinaten, indem du auf das "+" im Level-Tab klickst. Bewege die Bühne erneut in X/Y-Richtung, bis ein neuer ROI gefunden wird, und speichere die Koordinaten erneut, indem du auf das "+" klickst. Mach weiter, bis die gewünschte Anzahl an Regionen gespeichert ist.
HINWEIS: Im Fall der Fluoreszenzbildaufnahme sollte darauf achten, dass die Interessenbereiche (ROIs) nicht zu nah beieinander liegen, um die Phototoxizität zu minimieren.
- Überprüfen Sie noch einmal, ob die Zellen scharf sind, indem Sie auf die verschiedenen gespeicherten X- und Y-Positionen klicken, und starten Sie den Hardware-Autofokus, indem Sie AFC halten , um die gespeicherte Z-Position während des Experiments konstant zu halten.
- Starten Sie die Zeitrafferaufnahmen in der Mikroskopsteuerungssoftware, indem Sie im Multidimensionalen Erfassungs-Assistenten auf Acquire klicken.
HINWEIS: Für jede aufgenommene Wellenlänge erscheint ein Fenster, und ein weiteres Fenster zeigt die Anzahl der erfassten Zeitpunkte und die Zeit bis zur nächsten Bildaufnahme. - Überprüfen Sie, ob die Zellen nach den ersten Zeitpunkten in den Zeitrafferaufnahmen noch scharf sind, um die Bildqualität zu maximieren, und fokussieren Sie bei Bedarf neu.