Lebendzell-Zeitraffer-Bildgebung von Bdellovibrio bacteriovorus Prädation auf E. coli

Zusammenfassung

Quelle: Makowski, Ł., et al. Lebendzellbildgebung des Lebenszyklus des bakteriellen Räubers Bdellovibrio bacteriovorus mittels Zeitrelapse-Fluoreszenzmikroskopie. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung von Bdellovibrio bacteriovorus , der sich auf immobilisierten E. coli unter einem Agarose-Pad ernährt, was eine Echtzeitvisualisierung intrazellulärer Replikation und Nachkommenfreisetzung ermöglicht, um bakterielle Prädation und Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen.

Protokoll

1. Leitung der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie

1. Stellen Sie die 35-mm-Schale in den Petrischalenhalter, sodass sie sich während des Experiments nicht bewegt. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl (1,518 Brechungsindex) sowohl auf das Objektiv als auch auf den Boden der 35-mm-Schüssel.
2. Montieren Sie den Halter auf der Stufe des umgekehrten Mikroskops in der Mikroskopkammer.
3. Richte die Optionen in der Mikroskopsteuerungssoftware ein, um mehrere Bilder an verschiedenen Stufenpositionen über die Zeit zu erfassen.
   1. Stellen Sie die Vergrößerung (100x) und die polychrome Linse (GFP (grünes fluoreszierendes Protein)/mCherry) ein. Mit einem Okular und einem Hellfeld (BF) finden Sie die Brennebene und öffnen Sie den Punktlistenmanager.
   2. Wählen Sie mindestens 10 interessante Positionen aus, indem Sie die Stufe verschieben und die Koordinaten für jede Position in der Mikroskopsoftware speichern, indem Sie auf die Markierungs-Punkt-Schaltfläche klicken. Vermeiden Sie nahe beieinander gelegene Positionen, um Photobleaching und Fototoxizität zu verhindern. Drehen Sie das Kameraventil vom Okular zum Monitor und kalibrieren Sie jeden Punkt, indem Sie die Brennebene einstellen und im Punktlistenmanager auf die Schaltfläche "Punkt ersetzen " klicken.
   3. Öffnen Sie den Experimentdesigner und setzen Sie alle experimentellen Parameter in jedem Tab wie folgt:
      1. Die Z-Stapelbox abmarkieren .
      2. Wählen Sie Leuchtstoffröhrenkanäle und stellen Sie die optimalen Beleuchtungseinstellungen ein. Hier wurden folgende Einstellungen verwendet: für den mCherry-Kanal, mCherry-Filtersets (EX575/25; EM625/45), 50 % Intensität und 200 ms Belichtungszeit; für den GFP-Kanal, GFP-Filtersatz (EX475/28; EM525/48), 50 % Intensität und 80 ms; und für die BF-Bilder, POL-Kanal, 5 % Intensität und 50 ms.
      3. Wählen Sie Intervalle zwischen der Bildaufnahme und der Gesamtzeit des Experiments. Hier wurden 5-Minuten-Intervalle über den 10-Stunden-Zeitraum des Experiments durchgeführt.
      4. Aktivieren Sie die Fokuserhaltung für die gewählten Positionen (für das hier verwendete System, indem Sie das Kontrollkästchen Fokus mit UltimateFocus halten ) markieren).
      5. Wählen Sie den Datenordner aus, in dem die Bilddateien automatisch gespeichert werden sollen.
      6. Überprüfe alle Einstellungen in der Kontrolle der Mikroskop-Software erneut und starte dann das Zeitraffer-Experiment.
4. Nach der ersten Stunde des Experiments überprüfen Sie, ob alle Bühnenpositionen noch scharf sind. Passen Sie den Fokus während der Zeiträume zwischen der Bildaufnahme bei Bedarf an.
5. Wenn das Zeitraffer-Experiment abgeschlossen ist, entferne die Petrischale und benutze die 35-mm-Schale mit einem Agarose-Pad gemäß dem Biosicherheitsprotokoll.
   HINWEIS: Alle Unterschritte nach Schritt 1.2 sind spezifisch für DeltaVision Elite-Nutzer. Forscher, die andere Systeme verwenden, müssen die Einstellungen je nach System anpassen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zertifizierte Molekularbiologie Agarose	BIO-RAD	161-3100	Agarose mit niedriger Fluoreszenz für Agarose-Pad
Fidschi	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Open-Source-Bildverarbeitungspaket
Glasbodenschale 35 mm	Ibidi	81218-200	Unbeschichtetes Glas
Mikroskop	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, ultimatives Fokuslasermodul, DV Elite CoolSnap HQ2 Kamera, SSI-Montage FP DV, Bausatz objud. Oly 100x Öl 1.4 NA, Prisma Nomarski 100x LWD DIC, ENV Ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Start SoftWoRx	GE		Hersteller bereitgestellte Bildgebungssoftware