Visualisierung der bakteriellen Proteinverteilung in drei Dimensionen durch Fluoreszenzbildgebung

Zusammenfassung

Quelle: Bratton, B. P. et al., Dreidimensionale Bildgebung von Bakterienzellen für genaue zelluläre Darstellungen und präzise Proteinlokalisierung. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert die Methode zur Erfassung und Analyse dreidimensionaler Fluoreszenzbilder bakterieller Zellen, um die Proteinorganisation auf Einzelzellebene zu untersuchen.

Protokoll

1. Bildverarbeitung

1. Setzen Sie den versiegelten Objektträger auf das Mikroskop ein und lassen Sie ihn 5 Minuten stehen, um die Temperatur mit der Umgebung auszugleichen. Der Mikroskopraum kann eine andere Temperatur haben als der Probenvorbereitungsraum.
2. Nehmen Sie einen fluoreszierenden Z-Stack der Probe.
   HINWEIS: Der Z-Stack sollte die Probe vollständig abdecken, mit einem Z-Abstand kleiner als die Schärfentiefe. Für ein 1,45 NA 100x Objektiv und ~1 μm dicke E. coli-Zellen funktionieren 40 Schritte mit 100 nm pro Schritt gut. Für größere Zellen oder Zellen, die nicht vollkommen flach auf der Oberfläche liegen, können 50 oder mehr Schritte erforderlich sein. Fügen Sie genügend Schritte hinzu und stellen Sie sicher, dass die Probe oben und unten vollständig verschwommen ist.
   1. Verwenden Sie die mit dem Mikroskop verbundene Software (siehe Materialtabelle), um das Mikroskop zu steuern.
   2. Fokussiere auf die Mitte der Zelle mit den Fokusrädern des Mikroskops. Unter ND-Übernahme kreuze das Z-Kästchen an, um einen Z-Stack zu nehmen. Klicken Sie auf die Home-Taste, um die Mitte der Zelle als Startpunkt einzustellen. Stellen Sie die Schrittweite auf 0,1 μm ein und setzen Sie den Bereich auf 4 μm. Stelle sicher, dass das Z-Gerät auf die Piezo-Stufe eingestellt ist.
   3. Stellen Sie die fluoreszierenden Kanäle unter dem Lambda-Fenster auf die Einstellungen für die abgebildeten fluoreszierenden Moleküle ein. In diesem Experiment wurden GFP und mCherry verwendet.
      HINWEIS: Nehmen Sie einen zusätzlichen Z-Stack mit derselben Schrittgröße und Reichweite im zweiten Farbkanal, wenn die 3D-Verteilung eines zusätzlichen fluoreszierenden Kanals gewünscht ist. In diesem Experiment wurde zytoplasmatisches mCherry zur Bestimmung der Zellform verwendet, und MreB-GFP als zweiter Farbkanal.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Order of Experiment auf Lambda (z-Reihe) gesetzt ist, sodass in jedem Farbkanal vor dem Wechsel ein vollständiger z-Stack aufgenommen wird.
   5. Klicken Sie auf Jetzt ausführen, um die Bildaufnahme zu starten und die Datei zu speichern, sobald einer oder beide Z-Stacks abgeschlossen sind.
   6. Bewegen Sie sich in einen neuen Bereich auf dem Pad und wiederholen Sie die Schritte 1.2.2-1.2.5.

2. Zellrekonstruktion

1. Schneide einzelne Zellen zu und speichere die Bilder als gestapelte TIFF-Datei, sodass pro Datei nur eine Zelle vorhanden ist. Stellen Sie sicher, dass diese Zelle gut von anderen Zellen isoliert ist (d. h. etwa das 5-fache der vollbreiten Hälfte der Unschärfefunktion in xy).
   HINWEIS: Dies kann mit frei verfügbarer Bildanalysesoftware erfolgen (siehe Materialtabelle).
   1. Zeichne ein Feld um eine einzelne Zelle und dupliziere diese Zelle zweimal, einmal für jeden Kanal. Stelle sicher, dass das Duplikat-Hyperstack-Kästchen angekreuzt ist, und ändere den Kanal auf entweder 1 oder 2, wobei die Slices den gesamten Z-Stack enthalten.
      HINWEIS: Wenn man nur die Form der Zellen abbildet und kein zusätzliches fluoreszierendes Protein, ist nur ein Kanal vorhanden.
   2. Sobald beide Stapel verfügbar sind, gehe zu Images | Stapel | Werkzeuge | Verbinden Sie die Bilder zunächst mit dem Proteinkanal und anschließend dem Formkanal.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Wattestäbchen	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	Wurde verwendet, um VaLaP zu appizieren
Deckblätter	VWR	16004-302
Fidschi	ImageJ	https://fiji.sc	Verwendet zum Cro-Zellen
Lanolin	Sigma-Aldrich	L7387	Kombinieren Sie mit Paraffin und Valine, um VaLaP herzustellen
LB-Wachstumsmedium	BD Difco	DF0446173
M63 Medium	US Biological	M1015
MATLAB	Mathematikwerke		Musste Konfaltungsskripte vorwärts laufen lassen
Objektträger mit dem Mikroskop	Fisher	12-550-133
NIS-Elemente	Nkon
Paraffin	Sigma-Aldrich	327212
Vaseline	Gleich	49035-038-27
Piezo-z-Bühne	Nikon	77011589
Pipetenspitzen -p200	USA Scientific	1111-0730
Pipetspitzen – S. 10	USA Scientific	1111-3730