Visualisierung der bakteriellen Proteinverteilung in drei Dimensionen durch Fluoreszenzbildgebung

Abstract

Quelle: Bratton, B. P. et al., Dreidimensionale Bildgebung von Bakterienzellen für genaue zelluläre Darstellungen und präzise Proteinlokalisierung. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert die Methode zur Erfassung und Analyse dreidimensionaler Fluoreszenzbilder bakterieller Zellen, um die Proteinorganisation auf Einzelzellebene zu untersuchen.

Protocol

1. Bildverarbeitung

1. Setzen Sie den versiegelten Objektträger auf das Mikroskop ein und lassen Sie ihn 5 Minuten stehen, um die Temperatur mit der Umgebung auszugleichen. Der Mikroskopraum kann eine andere Temperatur haben als der Probenvorbereitungsraum.
2. Nehmen Sie einen fluoreszierenden Z-Stack der Probe.
   HINWEIS: Der Z-Stack sollte die Probe vollständig abdecken, mit einem Z-Abstand kleiner als die Schärfentiefe. Für ein 1,45 NA 100x Objektiv und ~1 μm dicke E. coli-Zellen funktionieren 40 Schritte mit 100 nm pro Schritt gut. Für größere Zellen oder Zellen, die nicht vollkommen flach auf der Oberfläche liegen, können 50 od....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Wattestäbchen	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	Wurde verwendet, um VaLaP zu appizieren
Deckblätter	VWR	16004-302
Fidschi	ImageJ	https://fiji.sc	Verwendet zum Cro-Zellen
Lanolin	Sigma-Aldrich	L7387	Kombinieren Sie mit Paraffin und Valine, um VaLaP herzustellen
LB-Wachstumsmedium	BD Difco	DF0446173
M63 Medium	US Biological	M1015
MATLAB	Mathematikwerke		Musste Konfaltungsskripte vorwärts laufen lassen
Objektträger mit dem Mikroskop	Fisher	12-550-133
NIS-Elemente	Nkon
Paraffin	Sigma-Aldrich	327212
Vaseline	Gleich	49035-038-27
Piezo-z-Bühne	Nikon	77011589
Pipetenspitzen -p200	USA Scientific	1111-0730
Pipetspitzen – S. 10	USA Scientific	1111-3730