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1. Bestimmung der intestinalen Besiedlungswerte
HINWEIS: Die intestinale Besiedlung ist die nützlichste Kennzahl im Zebrafischmodell, da sie verwendet werden kann, um die relative Fitness verschiedener V. cholerae-Stämme oder die Auswirkungen von Mutationen oder Gen-Knockouts zu vergleichen.
1. Euthanasie
1. Wenn das Experiment seinen gewünschten Endpunkt erreicht hat, entnehmen Sie eine Probe des Infektionswassers (15 ml sind in der Regel ausreichend), um ausgeschiedene Bakterienzählungen und gegebenenfalls die Messung von Durchfall (wie Mucin-Assay, Proteingehalt und/oder OD) zu ermöglichen.
2. Den Rest des Wassers durch ein Netz (um die Fische zu fangen) in Bleichmittel zu gießen, um die V. cholerae im Wasser abzutöten.
3. Geben Sie den Fisch in einen Becher mit Infektionswasser sowie 336 μg/mL Ethyl-3-Aminobenzoat-Methanesulfonat (Trikain) und inkubieren Sie den Fisch 20 Minuten lang in dieser Tricainlösung bei RT.
HINWEIS: Die Netzstrümpfe wurden mit einer 10%igen Bleichlösung sterilisiert.
2. Sektion
1. Zubereitung von Fisch
1. Schöpfen Sie einen Fisch mit einem Einweg-Plastiklöffel aus der Trikainlösung und legen Sie ihn auf die Sezierfläche.
2. Positionieren Sie den Fisch so, dass die Bauchseite nach oben zeigt, und stecken Sie ihn durch den Unterkiefer, wobei das stumpfe Ende der Nadel schräg vom Körperzentrum weg ist. Setze eine weitere Nadel direkt hinter dem Anus ein, ebenfalls vom Körper weggerichtet.
2. Exposition des Darmtrakts
1. Die Bauchseite des Fisches mit einem fusselfreien Tuch in 70 % Ethanol abwischen lassen.
2. Sterilisiere ein Skalpell und Vannas-Schere, indem du sie in 70 % Ethanol tauchst und entzündest.
3. Machen Sie einen kleinen Schnitt längs im Bauch, direkt unter der Haut, indem Sie die Schuppen durchdringen und das Skalpell verwenden. Seien Sie vorsichtig, nicht zu tief zu schneiden, da sich der Darmtrakt direkt unter der Haut befindet.
4. Mit der Schere den Schnitt vorsichtig entlang des Körpers verlängern, nicht tiefer als auf Hauthöhe schneiden und den Anus vermeiden.
5. Machen Sie zwei seitliche Schnitte mit der Schere zum Kopf des Fisches, um eine Öffnung des Schnitts zu ermöglichen.
6. Die Haut auf jeder Seite der seitlichen Einschnitte an der Sezionsfläche festnageln, wobei die Nadeln nach außen und weg vom Körper ausgerichtet sind.
HINWEIS: Die Spitzen der Nadeln wurden zuvor durch Brennen mit Alkohol sterilisiert.
3. Entfernung des Darmkanals
HINWEIS: Der Darmtrakt sollte als blasses, sehr dünnes Rohr auf den anderen Organen sichtbar sein.
1. Flammensterilisieren Sie die Pinzette und verwenden Sie sie dann, um den gesamten Darmtrakt (typischerweise 12–15 mm lang) zu entfernen. Legen Sie den Darm in ein Homogenisierungsrohr mit Glasperlen (siehe Schritte 1.3.1–1.3.2) und 1 ml 1x PBS oder LB auf Eis.
3. Homogenisierung
1. Bereiten Sie die Homogenisierungsröhren im Voraus vor, indem Sie ~1,5 g 1-mm-Glasperlen in 2-mL-Schraubverschlussrohre gießen (etwa zur Hälfte füllen) und anschließend durch Autoklavierung sterilisieren.
2. Fügen Sie 1 ml sterile LB oder 1x PBS hinzu.
3. Sobald die Zebrafisch-Därme (Schritt 1.2.3.1) an die Röhren angebracht wurden, schrauben Sie die Kappen sehr fest an und sichern Sie die Röhren dann im Vortex-Homogenisator.
4. Homogenisieren Sie die Proben für 1 Minute auf der maximalen Einstellung und kühlen Sie sie dann 1–2 Minuten auf Eis. Wiederholen Sie diesen Homogenisierungszyklus noch einmal für eine vollständige Homogenisierung. Hinweis: Mehrere alternative Methoden zur Homogenisierung funktionieren ebenfalls.
4. Quantifizierung der Darmbesiedlungsniveaus
1. Bereiten Sie Röhrchen (entweder kleine Glasreagenzgläser oder 1,5 mL Mikrozentrifugenröhren) für die serielle Verdünnung des Homogenats vor, indem Sie 900 μL LB oder 1x PBS zu jeder Röhre hinzufügen. Für jeden Fisch bereiten Sie 5–6 Röhrchen vor und führen 10-fache serielle Verdünnungen des Darmhomogenats vor, indem Sie 100 μL Homogenat in das erste Rohr geben, es zum Mischen vortexen lassen und dann 100 μL vom ersten Rohr in das zweite hinzufügen.
2. Wiederholen Sie dieses Verfahren, bis alle Verdünnungen vorbereitet sind.
3. Platte 100–200 μL jeder Verdünnung auf LB-Agarplatten mit 100 μg/mL Streptomycin (bei Verwendung von Streptomycin-resistenten Stämmen) und 40 μg/mL X-gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-galactopyranosid). Inkubieren Sie die Platten bei 30 °C für 16–18 Stunden.
4. Nach der nächtlichen Brutzeit werden die V. cholerae-Kolonien auf den Platten gezählt, entweder mit einem automatischen Kolonienzähler oder manuell gezählt; Es ist hilfreich, die gezählten Kolonien mit einer Markierungsspitze zu markieren.
5. Bestimmung des CFU pro Fischdarm durch Multiplikation der Plattenanzahl mit dem Verdünnungsfaktor der Suspension unter Berücksichtigung des verplattenten Volumens.