Darmbesiedlung und Durchfallinduktion durch Vibrio cholerae bei erwachsenen Zebrafischen

Zusammenfassung

Quelle: Nag, D., et.al. Quantifizierung der Besiedlung und Durchfall von Vibrio cholerae im erwachsenen Zebrafischmodell. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert die Impfung erwachsener Zebrafische mit einem pathogenen Vibrio-cholerae-Stamm , um die Darmbesiedlung und die Krankheitsverläufe zu untersuchen. Es zeigt, wie bakterielle Toxine die Darmintegrität stören, was zu Flüssigkeitsverlust, Schleimsekretion und wässrigem Durchfall führt, bevor die Fische für weitere Analysen vorbereitet werden.

Protokoll

1. Impfung von Zebrafischen durch Eintauchen
   HINWEIS: Diese Art der Exposition ähnelt dem natürlichen Infektionsverlauf.
   1. Zubereitung von Vibrio cholerae
      1. Inokulieren Sie 5 ml Lysogeniebrühe (LB) mit einer isolierten V.-cholerae-Kolonie von einer LB-Platte und inkubieren Sie sie bei 37 °C mit Schütteln (180 U/min) für 6–8 Stunden (Übernachtkultur).
      2. Inokulieren Sie 25 ml frisches, autoklaviertes LB-Medium in einem 250 ml konischen Kolben mit 50 μL der oben genannten Übernachtkultur. Inkubieren Sie es 16–18 Stunden bei 37 °C mit Schütteln (150 U/min).
      3. Lesen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) einer 1/10-Verdünnung der Übernachtkultur ab, um die Anzahl der Bakterien pro ml zu schätzen (der OD₆₀₀ = 1 entspricht ~10⁹ CFU/mL).
      4. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 6.000 g für 10 Minuten entnommen. Entferne das Medium mit einer Pipette oder gieße es in eine Desinfektionslösung. Die Zellen werden in sterilem PBS auf die gewünschte Konzentration resuspendiert, typischerweise zwischen 1 x 10,⁷ bis 1 x 10 oder¹⁰ ml PBS.
         HINWEIS: Hier sprechen wir von autoklaviertem umgekehrtem Osmosewasser mit 60 mg/L Meersalz als steriles Infektionswasser.
   2. Impfung und Brüt
      1. Geben Sie vier oder fünf Zebrafische in einen 400-ml-Becher mit 200 ml sterilem Infektionswasser.
      2. Fügen Sie 1 ml V. cholerae hinzu, um die gewünschte Infektionskonzentration (typischerweise 5 x 10,⁴ bis 5 x 10,⁷ CFU/mL) in 200 ml Infektionswasser zu erhalten.
      3. Decken Sie das Becherglas mit einem perforierten Deckel ab, damit der Fisch nicht herausspringt; die Oberseite einer 200-μL-Tipbox eignet sich dafür gut.
      4. Beschriften Sie jeden Becher und setzen Sie ihn für die Dauer des Experiments in einen Glasfront-Inkubator mit 28 °C.
   3. Verfahren zur vorübergehenden Exposition
      HINWEIS: Eine vorübergehende Exposition gegenüber V. cholerae (typischerweise 6 H) gefolgt von der Entfernung der impfenden Bakterien ist nützlich, um die Übertragung zu untersuchen und die ausgeschiedene Bakterien genauer quantifizieren zu können.
      1. Nach 6 Stunden Exposition gießt man das Becherwasser durch ein Netz aus, um die Fische aufzufangen. Entsorge das infizierte Wasser in einen Behälter mit Bleichmittel, um die V. cholerae abzutöten.
      2. Geben Sie den entfernten Fisch in einen Becher mit 200 ml sterilem Infektionswasser. Lassen Sie die Fische 5 Minuten in diesem sauberen Wasser schwimmen, um die Oberflächenbakterien aus dem Fisch zu entfernen.
      3. Wiederholen Sie das Netzverfahren und legen Sie die Fische in einen neuen Becher mit 200 ml sterilem Infektionswasser. Halten Sie die Fische während des gesamten Experiments in diesem Becher.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Instrument
Inkubator	NUAIRE, Plymouth, MN	Auto-Flow
Materialien
400-ml-Glasbecher	Pyrex
Perforierte Deckel	Mikrotip-Halter mit Löchern aus der Tippbox
Aquariumsystem	Aquaneering, San Diego, CA
RO Wasserreiniger	Aqua FX	TK001
Fischernetz	Marina
Fischfutter	Tetraflosse
Petriplatte	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1,5 ml Zentrifugenröhre	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
Reagenzgläser	Pyrex	9820
Mikropipetten	Sartorius Biohit, Göttingen, Deutschland	M1000/M200/M20
Tipps	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
LB Medium
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Hefeextrakt	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010