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1. Herstellung von Nematoden-Wachstumsmediumplatten (NGM) zur Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Bakterien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans (C. elegans)
- Geben Sie 1,25 g Pepton, 1,5 g NaCl, 8,5 g Agar, einen magnetischen Rührer und 487,5 ml destilliertes Wasser in eine 500 ml Glasflasche.
- Die Mischung gut mischen, sie 15 Minuten lang bei 121 °C autoklavieren und 30 Minuten in einem Wasserbad auf 55 °C abkühlen.
- Entfernen Sie das Medium aus dem Wasserbad, geben Sie die Komponenten (0,5 mL 1 M CaCl2, 0,5 mL Cholesterin, 0,5 mL MgSO4, 12,5 mL KPO4) in das NGM und mischen Sie es gut.
HINWEIS: Alle einzelnen Komponenten müssen autoklaviert werden, außer Cholesterin (gelöst in absolutem Ethanol), und jeder experimentelle Schritt muss auf einer sauberen Werkbank durchgeführt werden. - Verteilt Sie 20 ml NGM auf jede 90 x 15 mm Petrischale und lassen Sie den Agar auf einer sauberen Werkbank bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) erstarren. Die NGM-Platten können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die NGM-Platten, die für die Färbung von FITC-dextran (Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran) verwendet wurden, wurden vorbereitet. 10 ml NGM wurden auf jede 60 x 15 mm Petrischale verteilt und auf einer sauberen Werkbank bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) erstarren lassen. - Entfernen Sie die Bakterienkultur aus dem 4 °C Kühlschrank und lassen Sie die Kultur gründlich vortexen, bevor Sie die Kultur auf die NGM-Platten verteilen.
- Fügen Sie jeder frischen NGM-Platte insgesamt 800 μL der Bakterienkultur hinzu und lassen Sie die Platten über Nacht in einem 20 °C-Inkubator trocknen.
HINWEIS: Für das erste Experiment (Abbildung 1) wurden zwei NGM-Platten mit E. coli OP50, eine NGM-Platte mit P. aeruginosa PAO1 und eine NGM-Platte mit E. faecalis-KCTC3206 vorbereitet. Für das zweite Experiment (Abbildung 2) wurden zwei NGM-Platten mit lebendem E. coli OP50, eine NGM-Platte mit lebendem P. aeruginosa PAO1 und eine NGM-Platte mit hitzeinaktiviertem P. aeruginosa PAO1 vorbereitet.
3. Vorbereitung alterssynchronisierter C. elegans
- Züchten Sie Würmer auf einer festen NGM-Platte und füttern Sie sie mit E. coli OP50, bis die gewünschte Population erreicht ist.
- Synchronisieren Sie die Eier entweder mit der zeitlich begrenzten Eiablage oder der Bleichlösung
4. Behandlung von Bakterien und FITC-dextran-Fütterung
- Inkubieren Sie die alterssynchronisierten Eier bei 20 °C für 64 Stunden auf NGM-Platten, ergänzt mit lebendem E. coli OP50 als Nahrung.
- Waschen Sie die alterssynchronisierten L4-Larven mit einem S-Puffer und übertragen Sie sie (mehr als etwa 500 Würmer) auf die NGM-Behandlungsplatten mit verschiedenen Bakterien und Chemikalien. Brüten Sie sie 48 Stunden bei 20 °C aus.
HINWEIS: Die Behandlungszeit kann je nach verwendeten Bakterien und Chemikalien zwischen 24 und 72 Stunden liegen. Die therapeutische oder präventive Wirkung von DIM kann auch bewertet werden, indem die Würmer mit Krankheitserregern vorbehandelt und anschließend mit DIM (dem therapeutischen Effekt) behandelt werden oder die Würmer mit DIM vorbehandelt und anschließend mit Krankheitserregern behandelt werden (die präventive Wirkung). - Um die mit FITC-Dextran ergänzten Platten vorzubereiten, mischen Sie 2 ml hitzeinaktiviertes E. coli OP50 mit 4 mg FITC-Dextran. Anschließend teilen Sie 100 μL der FITC-dextran- und E. coli OP50-Mischung in zwanzig frische NGM-Agarplatten (60 mm x 15 mm) und lassen Sie die Platten 1 Stunde auf einer sauberen Werkbank trocknen.
HINWEIS: Die Endkonzentration von FITC-Dextran in jeder NGM-Platte beträgt 20 μg/mL. - Bereiten Sie fünf NGM-Platten mit E. coli OP50 ohne FITC-Dextran für die Fahrzeugsteuerung vor. Zu diesem Zweck werden 100 μL wärmeinaktiviertes E. coli OP50 auf jede frische NGM-Agarplatte (60 mm x 15 mm) verteilt und die Platten 1 Stunde auf einer sauberen Werkbank trocknen lassen.
HINWEIS: Für jedes unabhängige Experiment werden fünfzehn FITC-dextran-ergänzte NGM-Platten und fünf NGM-Platten ohne FITC-Dextran benötigt. - Nach 48 Stunden Behandlung (ab Schritt 7.2) werden die Würmer mit S-Puffer gewaschen, die Würmer auf die mit FITC-Dextran ergänzten Platten und die NGM-Platten ohne FITC-Dextran übertragen und die Platten über Nacht (14–15 H) inkubiert.
HINWEIS: Für jede Behandlungsgruppe sind 5 Replikationen der FITC-dextran-Färbung (oder Fahrzeugkontrollfärbung) erforderlich. - Wasche die Würmer mit S-Puffer und lasse sie 1 Stunde in der frischen NGM-Agarplatte kriechen.
HINWEIS: Für jedes unabhängige Experiment werden insgesamt 20 frische NGM-Platten benötigt. In diesem Schritt können Sie die NGM-Platte mit oder ohne E. coli OP50 ergänzen. - Fügen Sie 50 μL 4%ige Formaldehydlösung in jede Mulde einer schwarzen 96-Well-Flachbodenplatte hinzu. Übertragen Sie etwa 50 Würmer von jeder NGM-Platte in jede Bohrung für Fluoreszenzmessungen. Nach 1 bis 2 Minuten wird das gesamte Formaldehyd aus jedem Brunnen gründlich entfernt und 100 μL Montagemedium hinzugefügt, um die Bohrlöcher zu beschichten.
HINWEIS: Formaldehydlösung (4 %) wird verwendet, um die Würmer zu immobilisieren und zu reparieren. Für jede Behandlungsgruppe werden 5 Brunnen (5 Replikate) für die Bildanalyse verwendet.
5. Bildgebung von C. elegans mit dem Operetta-Bildgebungssystem und Bestimmung der Darmpermeabilität durch Messung der Fluoreszenzaufnahme von FITC-dextran
HINWEIS: Fluoreszierende Stereomikroskopie kann für die Bildanalyse anstelle des Operetta-Systems verwendet werden.
- Erfassen Sie Fluoreszenzbilder und messen Sie die Fluoreszenzintensität mit dem Operetta High-Content Imaging System und analysieren Sie die Bilder mit der Harmony-Software.
- In der Harmony-Software drücken Sie das Symbol Deckel öffnen , um den Deckel zu öffnen und die Platte in die Maschine zu legen.
- Stellen Sie die Parameter ein.
- Klicken Sie auf Einrichten, wählen Sie den Plattentyp aus (96-Well-Corning Flat-Bottom) und fügen Sie die Kanäle hinzu (Hellfeld- und EGFP-Kanäle).
- Passe das Layout an. Gehe zur Layout-Auswahl, wähle dann Track und passe die Parameter an (erstes Bild bei 1 μm, Anzahl der Ebenen ist 10, Abstand 1 μm).
- Wählen Sie einen der Behandlungsbrunnen und ein Aufnahmefeld aus und drücken Sie auf Test, um zu prüfen, ob die Bilder im Abschnitt Experiment ausführen zufriedenstellend sind.
- Wenn die Bilder zufriedenstellend sind, kehre zum Bereich Einrichten zurück und drücke das Reset-Symbol am Ende des Bildschirms. Wählen Sie dann alle Zielbohrungen und eine geeignete Anzahl von Erfassungsfeldern aus.
- Gehe nochmal zum Experiment ausführen , gib den Kennzeichennamen ein, dann drücke Start, um mit der Verarbeitung zu beginnen.
- Um die Intensität der Fluoreszenz zu messen, gehen Sie zum Bildanalyseabschnitt und geben Sie das Bild ein. Finden Sie die Zelle, indem Sie den EGFP-Kanal (Enhanced green fluorescent protein) und Methode B wählen. Stellen Sie den gemeinsamen Schwellenwert auf 0,5 an, die Fläche auf >200 μm2, den Split-Faktor auf 3,0, den individuellen Schwellenwert auf 0,18 und den Kontrast auf mehr als 0,18. Berechnen Sie dann die Intensitätseigenschaften und wählen Sie den Mittelwert als Ausgabe. Drücke das Symbol Anwenden , um das Setup zu speichern.
- Gehen Sie zum Abschnitt Evaluation , um die Intensität zu messen, indem Sie eine Heatmap und eine Datentabelle erhalten. Setzen Sie den Readout-Parameter auf Zellen — Intensitätszelle, EGFP-Mittelwert — Mittelwert pro Brunnen und beginnen Sie mit der Bewertung.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. - Um die Daten aus Operetta zu extrahieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellungen und wählen Sie Datenverwaltung.
- Wähle Archiv schreiben, öffne dann das Durchsuchen und wähle die Datei aus.
- Um die Datei auszuwählen, klicken Sie auf das kleine + Signal in der linken Ecke, dann auf Maß und wählen Sie Kennzeichenname.
- Wählen Sie die Datei aus und klicken Sie auf OK.
- Wählen Sie den Pfad zum Speichern der Datei aus, indem Sie auf das Browse-Signal am aktiven Pfad klicken.
- Klicken Sie auf Start, um die Datendatei zu speichern.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
