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Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.
1. Zubereitung von Salmonella Typhimurium ΔAroA-Kulturen zur oralen Meis-Gabe
- Aus einem gefrorenen Glycerolbestand von S. typhimurium ΔAroA wird eine Streifplatte mit Luria-Bertani-Agar (LB agar) mit 100 μg/mL Streptomycin und einer sterilen Impfschleife hergestellt. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Streakplatten können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
- Einen Tag vor der Infektion bereiten Sie das Antibiotikum vor, indem Sie 0,5 g Streptomycin in 2,5 ml Wasser auflösen. Nach der Filtersterilisation der Streptomycin-Lösung wird die Mäuse oral mit einer bulbförmigen 22G-Gavage-Nadel und einer 1 mL Spritze mit 100 μL Streptomycin-Lösung (20 mg Streptomycin/Dosis) geholt. Mit einer Inokulationsschleife inokulieren Sie 3 ml LB-Brühe (50 μg/mL Streptomycin) in einem Kulturröhrchen mit einer einzelnen Kolonie. Inkubieren Sie die Salmonellenkultur über Nacht aerob bei 37 °C und schütteln Sie bei 200 Umdrehungen pro Minute (RPM).
- Am Tag der Infektion bereiten Sie die endgültige Infektionsdosis vor, indem Sie zwei aufeinanderfolgende 1/10-Verdünnungen von nächtlichen Salmonellenkulturen in steriler Phosphat-Puffersalzlösung (PBS) durchführen. Dies würde zu einem 100 μL großen Inokulum führen, das etwa 3 x 106 Colony Forming Units (CFU) enthält.
- Mit einer bulbförmigen 22G-Gavage-Nadel und einer 1-ml-Spritze wird jede Maus mit 100 μL der zubereiteten Salmonellen versehen.
HINWEIS: Bereiten Sie Salmonellenkulturen mit aseptischen Techniken vor. Die endgültige Inokulationskonzentration von Salmonellen kann durch das Galvanisieren von seriellen Verdünnungen auf LB-Agar mit Streptomycin bestätigt werden.
2. Bewertung der Salmonellenlasten im Gewebe
- Bereiten Sie 2 ml Safe-Lock-Mikrotuben mit rundem Boden mit 1 ml sterilem PBS und einer autoklavierten Edelstahlperle vor. Wiegen Sie die Eileiter vor der Gewebeentnahme vor.
- Entfernen Sie das Fähl- und Milzgewebe von Mäusen, die durch Kohlendioxid eingeschläfert wurden. Sammeln Sie Gewebe von einzelnen Tieren in separaten Röhren. Wiegen Sie die Röhren, um das Gewebegewicht zu bestimmen.
- Homogenisieren Sie mit einer Mischmaschine für 15 Minuten bei 30 Hz. Übertragen Sie 900 μL PBS pro Bohrloch in einem 96-Bohrloch-2-mL-Megablock. Pipette 100 μL Gewebe homogeniert in das erste Bohrloch, mischt gut und führt serielle Verdünnungen durch Hinzufügen von 100 μL zu folgenden Bohrlöchern durch, bis eine 10⁻⁶-Verdünnung erreicht wird. Platte 10 μL jeder Verdünnung wird dreifach auf LB-Agar mit 100 μg/mL Streptomycin verdünnt.
- Zählen und multiplizieren Sie die durchschnittliche CFU mit einem Faktor 100, da 10 μL der 1000-μL-Probe verplateiert wurden, sowie der entsprechende Verdünnungsfaktor. Teilen Sie das Gewebegewicht des gesamten CFU durch das Gewebegewicht, um die CFU pro Gramm Gewebe zu bestimmen.
HINWEIS: Bewahren Sie alle Proben während der Gewebeverarbeitung auf Eis oder bei 4 °C auf. Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiten Öffnungen bei seriellen Verdünnungen mit Gewebehomogenaten. Bereiten Sie den 96-Well-Megablock mit PBS im Voraus vor.