Herstellung von Gardnerella vaginalis Inoculum zur Modellierung wiederkehrender Harnwegsinfektionen bei Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: O'Brien, V.P. et al. Wiederholende Harnwegsinfektion mit Escherichia coli ausgelöst durch Gardnerella vaginalis Blasenbelastung bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video demonstriert die Herstellung eines Gardnerella vaginalis-Inokulums zur Etablierung eines Mausmodells wiederkehrender Harnwegsinfektionen.

Protokoll

1. Gardnerella vaginalis inoculum bereiten
   HINWEIS: Alle Schritte werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt. Die idealen Inkubationszeiten der Kultur variieren zwischen verschiedenen Stämmen von G. vaginalis, wobei einige Stämme in die stationäre Phase eintreten und sogar schneller absterben als andere. Daher sollten die Inkubationszeiten für einen bestimmten Stamm empirisch bestimmt werden, bevor Experimente an Mäusen durchgeführt werden. Es ist unbekannt, ob andere oder alle Stämme von G. vaginalis in diesem Modell dieselben Effekte auslösen werden.
2. Streak G. vaginalis zieht von -80 °C Gefriermaterial auf eine NYCIII-Platte (ohne Antibiotika). Inkubieren Sie die Platte anaerob bei 37 °C für 24 Stunden.
3. In der anaeroben Kammer inokulieren Sie 5 ml anaerobes NYCIII-Medium mit einer 1 μL Zellenschleife (eine einzelne Kolonie reicht nicht aus) von der NYCIII-Platte und inkubieren Sie statisch Kultur bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen für 18 Stunden. Verwenden Sie keine Antibiotika in das Wachstumsmedium.
4. Bestimmen Sie den OD⁶⁰⁰ der Kultur mit einem Spektrophotometer
   1. Zentrifugiere ein definiertes Volumen (X) Kultur bei 9600 × g für 1 Minute und aspiriere das Medium. Berechnen Sie das Volumen (Y) an phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungsmittel (PBS), um das Pellet wieder aufzuhängen und so die gewünschte Inokulum-Optikdichte (OD) zu erreichen, um 10⁸ Koloniebildungseinheiten (CFU) in 50 μL mit folgender Gleichung zu erreichen: X mL × ODkultur = Y mL × ^OD-Inokulum , lösen Sie YY = (X ml × ODkultur) / ^OD-Inokulum
      HINWEIS: Das ^OD-Inokulum für JCP8151B^SmR beträgt 5, aber dies muss empirisch für andere G. vaginalis-Stämme bestimmt werden. Wenn beispielsweise 3 mL eines JCP8151B^SmR über Nacht flüssige Kultur mit ODculture = 2,0 gedreht wird: Y= (3 mL × 2,0) / 5,0; daher wird das Pellet in 1,2 mL PBS wieder suspendiert.
   2. Setzen Sie das bakterielle Pellet in PBS auf die gewünschte Konzentration auf. Das Inokulum in Serie verdünnen und plattieren, um die tatsächliche Inokulumsdosis zu bestimmen, die in jedem Experiment verwendet wurde. Verlassen Sie sich nicht einfach auf die OD-Werte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Glukose	Sigma	G7528	Für NYCIII G. vaginalis Wachstumsmedien
4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonsäure (HEPES)	Cellgro	25-060-Cl	Für NYCIII G. vaginalis Wachstumsmedien
Natriumchlorid	Sigma	S3014	Für NYCIII G. vaginalis Wachstumsmedien
Proteosepepton #3	Fisher	DF-122-17-4	Für NYCIII G. vaginalis Wachstumsmedien
Hefeextrakt	Fisher	DF0127-17-9	Für NYCIII G. vaginalis Wachstumsmedien
Spektrophotometer	BioChrom	80-3000-45	Messung des bakteriellen OD600
Streptomycin	Gibco	11860038	Fügen Sie G . vaginalis NYCIII Selektivplatten hinzu (1 mg/ml)