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Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.
1. Intranasale Impfung von Mäusen mit biofilmgezüchteten Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)
- Kaufen Sie Mäuse und verwenden Sie sie im gewünschten Alter.
HINWEIS: Mäuse im Alter von 3–4 Monaten werden bevorzugt, um junge Wirte zu modellieren, und Mäuse im Alter von 21–24 Monaten können zur Modellierung älterer Personen >65 Jahre verwendet werden. Die hier präsentierten Daten stammen von C57BL/6 männlichen Mäusen. - Taue die biofilmgezüchteten bakteriellen Aliquoten auf Eis auf und drehe sie bei 1.700 × g 5 Minuten lang. Entfernen und entsorgen Sie vorsichtig das Überlagerungsmittel, ohne das Pellet zu stören, waschen Sie die Bakterien, indem Sie das Pellet in 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) neu suspendieren, und lassen Sie es erneut bei 1.700 × g für 5 Minuten drehen. Entfernen Sie das Supernatant und setzen Sie das Pellet in dem benötigten Volumen auf, um die gewünschte Konzentration zu erreichen (zielen Sie auf 5 × 10 6 koloniebildende Einheiten (CFU)/10 μL für die intranasale Impfung). Bestätigen Sie die Menge an Bakterien, indem Sie das vorbereitete Inokulum auf Blutagarplatten anplattieren.
- Inokulieren Sie die Mäuse intranasal mit 5 × 106 CFU, indem Sie 5 μL des verdünnten Inokulums in jede Naris pipettieren. Achten Sie darauf, die Mäuse fest zu halten und den Kopf zu stabilisieren, bis das Volumen eingeatmet ist (typischerweise innerhalb von Sekunden nach dem Pipettieren des Volumens in die Nasen). Führen Sie diesen Schritt ohne Narkose durch, um eine Lungenaspiration des Inokulums zu verhindern.
2. Virusinfektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV)
- Nach 48 Stunden nach intranasaler Impfung mit S. pneumoniae wird der interessierende IAV-Stamm auf Eis aufgetaut.
HINWEIS: Die hier präsentierten Daten beziehen sich auf einen mausangepassten Stamm des Influenza-A-Virus A/PR/8/34 H1N1, der durch kollaborativen Austausch gewonnen wurde. - Sobald das Virus aufgetaut ist, wird das Virus in PBS auf die gewünschte Konzentration verdünnt; Streben Sie 20 plaquebildende Einheiten (PFU)/50 μL für intratracheale Infektionen und 200 PFU/10 μL für intranasale Infektionen an. Für künstlich infizierte und reine bakterielle Gruppen verwenden Sie PBS zur Impfung der Mäuse.
- Geben Sie vor der Anästhesie ein Augenmittel auf die Augen der Mäuse. Betäuben Sie die Mäuse mit 5 % Isofluran und bestätigen Sie die Anästhesie mit einem festen Zehenkneifen.
- Sobald das Tier betäubt ist, entferne es aus der Isoflurankammer und infiziere die anästhesierten Mäuse sofort mit 50 μL (20 PFU) IAV, intratracheal mit stumpfer Pinzette, um die Zunge aus dem Mund zu ziehen und das Volumen der Flüssigkeit in die Luftröhre zu pipetten.
- Setzen Sie die Mäuse in einen separaten Käfig und überwachen sie, bis sie vollständig genesen sind (sie können die sternale Liegeposition beibehalten [können aufrecht auf der Brust liegen]).
- Nach der Erholung wird die Mäuse sofort intranasal mit 10 μL (200 PFU) IAV mit der Impfmethode in Schritt 1.3 geimpft.
- Hausmäuse, die eine einzelne oder doppelte bakterielle und virale Infektion mit derselben Infektionsgruppe durchlaufen haben und sich von den anderen Gruppen getrennt haben.