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Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.
1. Verarbeitung infizierter Gewebe zur bakteriellen Aufzählung
- Lungensammlung
- Mit einer Sektionsschere schneiden Sie die Seiten des freiliegenden Brustkorbs auf und ziehen Sie die Rippen vorsichtig zum Kopf der Maus hinauf, um das Herz freizulegen. Führe eine 25-G-Nadel, die an eine 10-ml-Spritze befestigt ist, vorgefüllt mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in den rechten Ventrikel und beginne langsam mit dem Perfusieren. Achten Sie auf das Bleichen der Lunge als Indikator für eine erfolgreiche Perfusion. Spülen Sie langsam, um das Lungengewebe nicht zu beschädigen.
- Heben Sie das Herz mit der Pinzette an und machen Sie einen Schnitt, um Lunge und Herz zu trennen. Nach der Trennung nehmen Sie mit der Pinzette alle Lungenlappen auf und spülen Sie in einer Schale mit sterilem PBS ab, um eventuelle Blutreste zu entfernen. In einer Petrischale die Lunge in kleine Stücke zerkleinern und gut mischen. Entfernen Sie die Hälfte der Lungenmischung zur Bestimmung der bakteriellen koloniebildenden Einheiten (CFU) oder der viralen plaquebildenden Einheiten (PFU) und setzen Sie sie in ein rundes 15-ml-Rohr, das mit 0,5 ml PBS vorgefüllt ist, zur Homogenisierung.
HINWEIS: Es ist wichtig, für die verschiedenen Untersuchungen nicht verschiedene Lappen derselben Lunge zu nehmen. Stattdessen sollten alle Lappen gehackt, gut zusammengemischt und für die verschiedenen Bewertungen gleichmäßig verteilt werden.
- Um das gesammelte Gewebe zu homogenisieren, reinigen Sie zuerst die Homogenisator-Sonde, indem Sie sie in 70 % Ethanol geben und den Homogenisator bei 60 % Leistung für 30 Sekunden einschalten. Wiederhole den Schritt 10 Sekunden lang in sterilem Wasser. Homogenisiere jedes Gewebe für 1 Minute. Reinigen Sie die Homogenisator-Sonde in sterilem Wasser zwischen jeder Probe und in einem frischen Röhrchen mit 70 % Ethanol zwischen Organ und Probengruppe.
- Aufzählung der Bakterienzahlen
- Sobald alle Organe entnommen und homogenisiert wurden, erfolgt die Platten mit seriellen Verdünnungen auf den Blutagarplatten. Um die gesamte CFU zu berechnen, verwenden Sie 10 μL zur Plattierung und notieren Sie das Endvolumen in mL für jede Probe. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C/5 %CO2.