Erzeugung einer menschlichen Colonoid-Monoschicht mit Barrierfunktion zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Abstract

Quelle: In J. G. et al. Humane Colonoid-Monoschichten zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern, Kommmensalen und dem intestinalen Epithel des Wirts. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Kultivierung von Colon-abgeleiteten Epithelzellen auf einem kollagenbeschichteten Transwell-System, um eine schleimproduzierende Monoschicht zu erzeugen, die die Darmbarriere modelliert und Wirts-Pathogen-Interaktionsstudien ermöglicht.

Protocol

1. Beschichtung der Enteroid-/Colonoid-Suspension

1. Wenn beschichtete Einsätze bei 4 °C gelagert wurden, sollten sie sich mindestens 30 Minuten vor der Zellbeschichtung in einem 37 °C/5 % CO-2-Kulturinkubator ausgleichen.
2. Für jeden zu plattierenden Einsatz bereiten Sie 1 mL warmes (zwischen 25-37 °C) Expansionsmedium (EM) vor und fügen Sie 10 μM Y-27632 sowie 10 μM CHIR 99021 hinzu.
   HINWEIS: EM besteht aus Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) /F12 mit B27 (1x), 50 % WNT3A-konditioniertem Medium, 15 % RSPO1-konditioniertem Medium, 10 % Noggin-konditioniertem Medium, 50 ng/mL humanem EGF (Epidermal Growth Factor), 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, antimykotischem Cocktail (1x), 10 mM HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-Ethanesulfonsäure)), L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid (1x) und Penicillin-Streptomycin (1x) (siehe Materialtabelle).
3. Saugen Sie das Waschmedium aus dem Rohr mit dem Zellpellet ab und suspendieren Sie es in einem EM-Volumen, das mindestens 100 μL pro Insert ergibt.
4. Aspirieren Sie die Kollagen-IV-Lösung aus jedem Einsatz und waschen Sie zweimal mit 150 μL des Waschmediums pro Einsatz.
5. Pipettieren Sie 600 μL EM in den Raum unter jedem Einsatz.
6. Pipettieren Sie 100 μL Zellsuspension in jeden Einsatz.
7. Bringen Sie die Platte zurück in den Gewebekultur-Inkubator und lassen Sie sie mindestens 12 Stunden unberührt.
   HINWEIS: Vermeiden Sie das Schütteln oder scharfe Kippen der Platte, um eine ungleichmäßige Verteilung der Colonoid-Fragmente auf der Insert-Membran zu verhindern.
8. Überwachen Sie die Zellanheftung und Ausbreitung, um eine konfluente Monoschicht zu bilden, indem Sie die Platte unter einem 2,5-10x-Objektivobjektiv auf ein Phasenkontrast-Lichtmikroskop legen.
9. Nach 1-2 Tagen sollten die meisten Fragmente an der Kollagenmatrix haften. Erneuern Sie das Kulturmedium und beenden Sie die Behandlung mit Y-27632 und CHIR 99021. Erneuere das Medium weiterhin alle 2–3 Tage, bis es zusammenfließt. Der Zusammenfluss wird in der Regel in 7–10 Tagen erreicht.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Amino-2-(Hydroxymethyl)-1,3-Propandiol	Sigma	T4661	Tris-Base, Komponente des Lysis-Puffers
A-83-01	Tocris	2939	ALK4/5/7-Inhibitor
Essigsäure, Gletschersäure	Fisher Scientific	A38
Fortgeschrittenes DMEM/F12	Lebenstechnologien	12634-010	Komponente des Wachstumsmediums
Antibiotikum/Antimykotikum-Cocktail	Invivogen	ANT-PM-2	Primocin (100x)
B27, 50x	Lebenstechnologien	17504-044	Komponente des Wachstumsmediums
Zellkultur-Einsätze	Corning	3470	Transwell, PET-Membran, 0,4 μm Pore, 24-Well-Platte
CHIR 99021	Tocris	4423	GSK3β-Inhibitor
Kollagen IV, aus der menschlichen Plazenta	Sigma	C5533
Cultrex Organoid-Erntelösung	Trevigen	3700-100-01	Depolymerisiert die Basalmembranmatrix
Ethanol, absolut	Pharmco	111000200
GlutaMAX	Lebenstechnologien	35050-061	L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc-Zelllinie	van den Brink-Labor, Tytgat-Institut für Leber- und Darmforschung		Zur Herstellung von Noggin-konditioniertem Medium
HEK293T/RSPO1-Fc-HA-Zellleitung	Trevigen	3710-001-K	Zur Herstellung von Rspondin-1 konditioniertem Medium
HEPES, 1 M	Lebenstechnologien	15630-080	Komponente des Wachstumsmediums
Menschlicher epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	F&E-Systeme	236-EG-01M	Komponente des Wachstumsmediums
Invertiertes Zellkultur-Lichtmikroskop	Olympus	CKX51
L-WNT3A-Zelllinie	ATCC	CRL-2647	Für die Herstellung von Wnt3a konditioniertem Medium
Matrigel, Wachstumsfaktor reduziert	Corning	356231	Basementmembranmatrix für 3D-Kultur
Mini-Zellschaber	United BioSystems	MCS-200
MUC2-Antikörper, Maus-monoklonaal	Abcam	ab11197	Verwendung bei 1:100 für Immunfärbung, 1:500 für Immunblotting
MUC2-shRNA-lentivirale Partikel	GE Dharmacon	RHS4531	GIPZ lentivirale shRNA, ID: 4583
Orbitalshaker	Förderinstrumente	PSU-10i
Penicillin-Streptomycin, 100x	Lebenstechnologien	15140-122	Komponente des Wachstumsmediums
Sonen-Sonikator mit Mikrotip	Branson-Ultraschall	450
Proteaseinhibitor-Cocktail für Säugetierzellen	Sigma	P8340	Komponente des Lysispuffers
SB 202190	Tocris	1264	p38 MAPK-Inhibitor
Natriumchlorid	Sigma	S3014	Komponente des Lysispuffers
Natriumdexoycholat	Sigma	D6750	Komponente des Lysispuffers
Natriumdodecylsulfat	Sigma	L3771	Komponente des Lysispuffers
TrypLE Express, 1x	Lebenstechnologien	12605-010	Trypsin zur Verdauung von enteroiden/colonoiden Fragmenten
Vinculin-Antikörper, kaninchenmonoklonal	Abcam	ab129002	Verwendung bei 1:1000 zur Immunblotting
Wasser, Gewebekulturqualität, steril gefiltert	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	RhoA/ROCK-Inhibitor