Entstehung von Spheroplasten aus gramnegativen Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Figueroa, D. et al. Produktion und Visualisierung bakterieller Spheroplasten und Protoplasten zur Charakterisierung der Lokalisierung antimikrobieller Peptide. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert die Herstellung von Spheroplasten aus stabförmigen, gramnegativen Bakterien. Bakterien werden in Gegenwart eines Antibiotikums gezüchtet, um verlängerte Filamente zu bilden. Diese werden mit einer hypertonischen Lösung gewaschen und mit einem Lysepuffer behandelt, um die äußere Zellwand zu entfernen. Die hypotone Behandlung bildet Spheroplasten, die mit einer gekühlten isotonen Lösung stabilisiert und unter kalten Bedingungen gelagert werden.

Protokoll

1. Lösungsvorbereitung

HINWEIS: Bereiten Sie die in den Schritten 1.1–1.9 beschriebenen Lösungen vor, um Escherichia coli (E. coli) Spheroplasten zu erzeugen

1. Bereiten Sie 1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-Cl), pH 7,8 her, indem Sie 10,34 g Tris·HCl und 4,17 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris·OH) in 50 mL destilliertem Wasser (dH₂O) in einer 125 mL Kolben auflösen. Sterilisieren, indem man durch einen 25-mm-Spritzenfilter mit einer 0,2-μm-Membran filtert und bei Raumtemperatur in einem konischen Röhrchen lagert.
2. Bereite Lösung A (20 mM Magnesiumchlorid (MgCl₂), 0,7 m Saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) vor, indem 0,10 g MgCl₂ (95,2 g/mol) und 11,98 g Saccharose (342,3 g/mol) in 25 mL dH₂O in einem 125 mL Kolben gelöst werden. Fügen Sie 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 50 mL ein. Sterilisieren, indem man durch einen 25-mm-Spritzenfilter mit einer 0,2-μm-Membran filtert und bei Raumtemperatur in einem konischen Röhrchen lagert.
3. Bereite Lösung B (10 mM MgCl₂, 0,8 M Saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) vor, indem 0,05 g MgCl₂ (95,2 g/mol) und 13,69 g Saccharose (342,3 g/mol) in 25 mL dH₂O in einem 125 mL Kolben gelöst werden. Fügen Sie 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 50 mL ein. Sterilisieren, indem man durch einen 25-mm-Spritzenfilter mit einer 0,2-μm-Membran filtert und bei Raumtemperatur in einem konischen Röhrchen lagert.
4. Bereiten Sie 0,8 m Saccharose vor, indem Sie 13,69 g Saccharose (342,3 g/mol) in 50 mL dH₂O in einer 125 mL Flasche auflösen. Sterilisieren, indem man durch einen 25-mm-Spritzenfilter mit einer 0,2-μm-Membran filtert und bei Raumtemperatur in einem konischen Röhrchen lagert.
5. Bereiten Sie 5 mg/mL Desoxyribonuklease I (DNase I) her, indem Sie 0,015 g DNase I in 3 mL dH₂O in einer 50-mL-Flasche auflösen. Sterilisieren, indem man durch einen 25-mm-Spritzenfilter mit einer 0,2-μm-Membran filtert. Aliquot-Lösung in Mikrofuge-Röhren einführen und bei −20 °C lagern.
6. Bereiten Sie 0,125 m Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) mit pH 8,0 her, indem Sie 0,698 g EDTA-Dinatriumdihydrat (372,2 g/mol) in 15 mL dH₂O in einer 125 mL Flasche auflösen. Sterilisieren, indem man durch einen 25-mm-Spritzenfilter mit einer 0,2-μm-Membran filtert und bei Raumtemperatur in einem konischen Röhrchen lagert.
7. Bereiten Sie 600 μg/mL Cephalexin vor, indem Sie 0,03 g Cephalexinhydrat (365,404 g/mol) in 50 mL dH₂O in einem 125 mL Kolben auflösen. Sterilisieren, indem man durch einen 25-mm-Spritzenfilter mit einer 0,2 μm-Membran filtert und in einem konischen Rohr bei 4 °C lagert.
8. Bereiten Sie 5 mg/mL Lysozym vor, indem Sie 0,015 g Lysozym in 3 mL dH₂O in einer 50-mL-Flasche auflösen. Sterilisieren, indem man durch einen 25-mm-Spritzenfilter mit einer 0,2-μm-Membran filtert. Aliquot-Lösung in Mikrofuge-Röhren einführen und bei −20 °C lagern.
9. Bereiten Sie 3 % mit Trypticase-Sojabrühe (TSB) zu, indem Sie 30 g TSB in 1 L dH₂O in einer 2-Liter-Flasche auflösen. Aliquot die Lösung in Kolben mit 25 mL bzw. 100 mL TSB für die Herstellung von E. coli-Spheroplasten bzw. B. megaterium-Protoplasten verwenden. Autoklavenkolben, um das flüssige Medium zu sterilisieren. Sterile TSB kann entweder bei Raumtemperatur oder bei 4 °C gelagert werden.
10. Bereiten Sie Lösung C (1 M Saccharose, 0,04 M Maleat, 0,04 M MgCl₂, pH 6,5) vor, indem Sie 34,23 g Saccharose (342,3 g/mol), 0,46 g Maleinsäure (116,07 g/mol) und 0,38 g MgCl₂ (95,21 g/mol) in 100 ml dH₂O in einer 250 mL Flasche auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 ein. Sterilisieren, indem man durch einen 25-mm-Spritzenfilter mit einer 0,2-μm-Membran filtert und bei Raumtemperatur in einem konischen Röhrchen lagert.

2. Vorbereitung der Übernachtkultur

HINWEIS: Führen Sie die Abschnitte 2-3 mit geeigneten sterilen Techniken durch. Falls gewünscht, kann ein Bakterienstamm ein Plasmid für Antibiotikaresistenz enthalten, um die potenzielle Kontamination zu verringern. Wenn ein Stamm mit Antibiotikaresistenz verwendet wird, fügen Sie die notwendigen Antibiotika in den Schritten 2.1 und 3.1–3.2 hinzu.

1. Bereiten Sie eine Übernachtkultur vor, indem Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer sterilen Pipettenspitze aufnehmen und in ein 14-ml-Kulturrohr mit 2–3 ml 3 % mit Fleisch und Blut geben. Brüte bei 37 °C und schüttelte 16–21 Stunden.

3. Herstellung von gramnegativen E. coli-Spheroplasten

1. In einem 250-mL-Kolben wird die Übernachtkultur mit 1:100 in einem 25 mL Volumen von 3 % w/v TSB verdünnt und die bakterielle Lösung bei 37 °C inkubiert, während es etwa 2,5 Stunden geschüttelt wird, bis die Lösung eine optische Dichte von 0,5–0,8 bei 600 nm erreicht hat. Messen Sie die optische Dichte mit einem Spektrophotometer.
2. In einem 250-mL-Kolben wird diese Kultur um 1:10 in 30 mL mit 3 % w/v TSB verdünnt und bei 37 °C inkubiert, während man 2,5 Stunden in Gegenwart von 60 μg/mL Cephalexin (347,4 g/mol) schüttelt, um Einzelzellfilamente von etwa 50–150 μm Länge zu erzeugen, die unter 1.000-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop beobachtbar sind (Abbildung 1B).
3. Ernten Sie die Filamente, indem Sie die bakterielle Lösung bei 1.500 x g, 4 °C für 4 Minuten zentrifugieren. Kippen Sie das Supernatant aus und entsorgen Sie es, wobei Sie das Pellet aufbewahren.
4. Wasche die Filamente, indem du vorsichtig 1 ml 0,8 m Saccharose hinzufügst und darauf achte, das Pellet nicht zu stören. Inkubiere 1 Minute und entsorge dann das Supernatant, ohne das Pellet zu stören.
5. Fügen Sie 150 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 μL 5 mg/mL Lysozym, 30 μL 5 mg/mL DNase I und 120 μL 0,125 M EDTA in ihrer jeweiligen Reihenfolge dem Pellet hinzu und inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
6. Fügen Sie über 1 Minute allmählich 1 ml Lösung A zur in 3,5 Minuten hergestellten Lösung mit einer Mikropipette hinzu, während Sie die Lösung vorsichtig von Hand wirbeln. Die Lösung 4 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren lassen.
7. Gib 7 ml 4 °C Lösung B in zwei 15 mL konische Röhren. Geben Sie in jedem dieser beiden Röhrchen gleiche Mengen der in 3,6 hergestellten Lösungen. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.500 x g, 4 °C für 4 Minuten.
8. Entfernen Sie mit einer serologischen Pipette vorsichtig alles bis auf 1–2 ml Supernatant, ohne das Pellet zu stören. Die Kugel wird durch vorsichtiges Pipettern mit einer P1000-Mikropipette wieder auf- und abgefedert. Überprüfen Sie die Sferoplastbildung visuell, indem Sie die Probe bei 1.000-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop betrachten (Abbildung 1C).
9. Lagere die Spheroplasten bei -20 °C bis zu einer Woche oder bis sie drei Gefrier-Tau-Zyklen durchlaufen haben.

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Escherichia coli. (A) E.-coli-Bakterien , (B ) E. coli-Schlange und (C ) E. coli-Spheroplast . Die Bilder wurden mit 100-facher Vergrößerun...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Trizmahydroklorid (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma-Basis (Tris OH)	Sigma	T1503
Magnesiumchlorid	Sigma	M8266
Sucrose	Sigma	S7903
Lysozym	Sigma	L6876
Desoxyribonuklease I	Sigma	D4527
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma	106361	Sigma 106361 bei der ursprünglichen Protokollentwicklung verwendet; 106361 mit ED2SS als Ersatz eingestellt
Cephalexinhydrat	Sigma	C4895
BBL Trypticase Sojabrühe	Fisher Scientific	B11768
Malinsäure	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm Spritzenfilter mit 0,2 μm HT Tuffryn-Membran	Pall Corporation	4192