Etablierung eines Mausmodells der vaginalen Streptokokkeninfektion der Gruppe B

Zusammenfassung

Quelle: Patras, K. A., Doran, K. S. Ein Mausmodell der vaginalen Besiedlung von Gruppe B Streptokokken . J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert die Vorbereitung und vaginale Impfung einer hormonbehandelten weiblichen Maus mit Streptokokken der Gruppe B zur Modellierung der Infektion. Sie erklärt, wie man die Bakterien kultiviert und vorbereitet, das Inokulum in das vaginale Lumen verabreicht und eine erfolgreiche Infektion sicherstellt.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.

1. Vaginale Impfung mit Streptokokken der Gruppe B (GBS)

1. Einen Tag vor der Impfung sollte man eine 5-ml-Übernacht-Flüssigkultur eines interessanten GBS-Stamms, wie A909 (Serotyp Ia), in Todd Hewitt-Brühe (THB) bei 37 °C anbauen.
2. Subkulturieren Sie die GBS über Nacht mit einem Volumen von 1:10 in frisches THB und inkubieren Sie bei 37 °C. Wachsen Sie die Bakterien bis zur mittleren Logaritma-Phase (OD₆₀₀ = 0,4-0,5).

HINWEIS: Das dauert typischerweise 2 bis 3 Stunden, abhängig vom GBS-Stamm.

3. Übertragen Sie die Subkultur in ein steriles 15-ml-konisches Rohr und Pelletbakterien bei 3.000 × g für 5 Minuten. Aspiriere das Supernatant. Das bakterielle Pellet wird in 200 μl steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) erneut suspendiert.
4. Mit dem umgedrehten Pellet bringen Sie 3 bis 5 ml PBS (1 ml pro 10 Mäuse) genau auf OD₆₀₀ = 0,4 in einem neuen 5-ml-Kulturröhrchen. Dies wird eine Konzentration von ~ 1 × 108 koloniebildenden Einheiten (CFU)/ml haben. In ein neues 15-ml-konisches Rohr übertragen und die Bakterien bei 3.000 × g für 5 Minuten neu pelletieren. Aspiriere das Supernatant.
5. Das Pellet in PBS bei 1/10 der ursprünglichen Lautstärke wieder suspendieren. Wenn zum Beispiel 3 ml OD₆₀₀ = 0,4 pelletiert wurden, dann wird es in 300 μl PBS neu suspendiert.

HINWEIS: Dies ist die letzte bakterielle Suspension (~ 1 × 10,9 CFU/ml), die für die Tierimpfung verwendet wird.

6. Reservieren Sie 50 μl dieser Suspension für die serielle Verdünnung und Beschichtung auf THB-Agar, um das genaue Inokulum zu bestimmen.
7. Inokulieren Sie jede Maus mit 10 μl der finalen bakteriellen Suspension, sodass jeder Maus 1 × 10^{7 CFU} verabreicht wird.
   1. Um zu impfen, fixieren Sie die Maus manuell, indem Sie die lose Haut am Nackenstoppel zwischen Daumen und Zeigefinger des Hundeführers befestigen und dann den Schwanz immobilisieren.
   2. Ziehen Sie 10 μl GBS in eine 200-μl-Gel-Lade-Pipettenspitze auf. Führen Sie die Spitze 5 bis 10 mm in das vaginale Lumen ein und geben Sie das 10 μl Inokulum ab.
      HINWEIS: Gel-Loading-Spitzen werden Standard-200-μl-Spitzen vorgezogen, um das Risiko von Organverletzungen oder -verletzungen zu minimieren, insbesondere bei jüngeren oder kleineren Mäusen.
   3. Unmittelbar nach der Impfung löst man den Nackenstoppel und hebt das Hinterteil der Maus an, hebt die Maus am Schwanz an und läuft mit den Vorderpfoten auf einer harten Oberfläche ~ 1 Minute.
   4. Untersuchen Sie die Vaginalöffnung visuell auf einen Rückfluss von Inokulum. Wenn Rückfluss beobachtet wird, kann eine frische Pipettenspitze verwendet werden, um die Vaginalöffnung zu manipulieren oder zu vergrößern und so die Aufnahme des Rückflusses in das Lumen zu erleichtern. Zusätzlich kann der Rückfluss über eine Pipette aspiriert und erneut inokuliert werden.
      HINWEIS: Bei der Verabreichung topischer Wirkstoffe, probiotischer Organismen oder interessanter Proteine kann ein Volumen von bis zu 20 μl in einem physiologischen Puffer im Vaginaltrakt zugeführt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
200 μl Gel-Lade-Pipettenspitzen	USA Scientific	1252-0610
Todd Hewitt Brühe	Hardy-Diagnostik	7161C
Dulbeccos phosphatgepufferte Salzlösung 1x	Corning	21-031-CV