Quantifizierung enzyminduzierter Biofilmsuppression bei pathogenen Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Tay, S. B., et al. Antivirulente Störung pathogener Biofilme mit Engineered Quorum-Quenching Lactonasen. J. Vis. Exp. (2016)

Das Video demonstriert eine Methode zur Quantifizierung der Biofilmbiomasse in einem pathogenen Bakterium, indem unbehandelte Kontrollen mit Proben verglichen werden, die mit einem Quorum-Abschreckungsenzym behandelt wurden. Das Enzym stört die bakterielle Signalübertragung während der frühen Inkubation und verringert so die Zelladhäsion. Nach dem Waschen und weiterer Inkubation bilden Kontrollbrunnen dichte Biofilme, während behandelte Bohrlöcher eine reduzierte Bildung zeigen. Ein kationischer Farbstoff wird verwendet, um den Biofilm zu färben, und die Absorption wird gemessen, um die Biomasse zu bewerten.

Protokoll

1. Kristallviolette Quantifizierung der Biofilmbildung in A. baumannii S1

1. Eine 5-mL-Kultur von Acinetobacter baumannii S1(A. baumannii) in Lysogeny-Brühe (LB) (Trypton 10 g/L, Hefeextrakt 5 g/L) bei 30 °C in einem Schüttelinkubator (220 U/min) für 16 Stunden anbauen.
2. Stellen Sie die Kultur von A. baumannii S1 auf eine gewünschte optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) von 0,8 an. Mit einer 96-Well-Platte wird die Bakterienkultur (1:100 Verdünnung) in frisches LB mit 10 μl gereinigtem GKL-Enzym (40 mg/ml) inokuliert; Das letzte Volumen der neuen Kultur beträgt 100 μl.
3. Bereite auch eine Kontrollkultur vor; Das enthält kein Enzym. Wiederholen Sie ähnliche Bedingungen, um die gewünschte Anzahl von Replikationen zu erhalten.
4. Decken Sie den Teller mit einem Deckel ab und legen Sie ihn in einen versiegelten 10-Liter-Kunststoffbehälter. Inkubieren Sie den Teller bei 30 °C für 3 Stunden, bevor Sie das Medium vorsichtig entfernen.
5. Gib weitere 100 μl frisches LB-Medium in den Brunnen und inkubiere die Platte 21 Stunden lang bei 30 °C.
6. Nach der zweiten Inkubationsphase entfernen Sie vorsichtig das gesamte Medien. Waschen Sie die planktonische Bakterienzelle mit 200 μl sterilem Wasser. Stellen Sie sicher, dass die Zellen während des Waschens nur minimal gestört werden.
7. Geben Sie jedem Brunnen 100 μl 1% Kristall-Violettlösung hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Kristallviolettlösung, indem Sie den Brunnen mit 200 μl sterilem Wasser reinigen. Wiederhole das Spülen noch zweimal.
8. Geben Sie 100 μl 33 % Essigsäure zu jedem Brunnen und inkubieren Sie 15 Minuten lang mit sanftem Schütteln; Das löst den Farbstoff auf.
9. Quantifizieren Sie die Menge des gebildeten Biofilms, indem Sie die Absorption von Kristallviolett bei 600 nm messen. Die Menge an Kristallviolett ist proportional zur Menge des gebildeten Biofilms.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Trypton	BD	211705
Hefeextrakt	BD	212750
96-Well-Platte	Co-Star	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Essigsäure	Lab-Scan	PLA00654X	Vorsicht: Entflammbar
Synergy HT Mikroplatten-Leser	BioTek