1. Konfokale Laserscanningmikroskopie des A. baumannii S1 Biofilms
1. Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von A. baumannii S1 in LB bei 30 °C in einem Schüttelinkubator (220 U/min) für 16 Stunden.
2. Anpassung der Kultur von A. baumannii S1 auf einen gewünschten OD600 von 0,8. Mit einer 35 mm Glasboden-μ-Dish wird die Bakterienkultur (1:100-Verdünnung) in frisches LB mit 30 μl gereinigtem GKL-Enzym (40 mg/ml) inokuliert; Der Endvolumen der New Culture beträgt 1 ml.
3. Decken Sie die μ-Schüssel mit einem Deckel ab und geben Sie sie in einen versiegelten 10-Liter-Kunststoffbehälter. Inkubieren Sie die μ-Schüssel bei 30 °C 3 Stunden, bevor Sie das Medium vorsichtig entfernen. Fügen Sie 30 μl gereinigtes GKL-Enzym und frisches Medium hinzu, sodass das Gesamtvolumen 1 ml erreicht wird. Inkubiere weitere 21 Stunden bei 30 °C.
4. Wiederholen Sie Schritt 1.3 und inkubieren Sie die μ-Schüssel weitere 24 Stunden bei 30 °C. Dann entferne das Medium vorsichtig.
5. Fügen Sie 500 μl 5 μg/ml Alex Fluo 488-konjugiertes Weizenkeimagglutinin (WGA), gelöst in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS), zur μDish und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten; Dies verfärbt den gebildeten Biofilm. Entferne die Fleckenlösung und wasche die μ-Dish mit 2 ml HBSS. Wiederhole den Waschschritt noch einmal.
6. 500 μl 3,7 % Formaldehyd in HBSS gelöst und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren; Das wird den Biofilm am μ-Dish fixieren. Wasche die μDish einmal mit 2 ml HBSS und entferne dann die Lösung vollständig. Die mit Biofilm fixierte μ-Dish kann vor der CLSM-Bildgebung im Dunkeln bei 4 °C gelagert werden.
7. Für CLSM-Bildgebung und Analyse verwenden Sie 63-fache Vergrößerung, um 97 Stacks pro Bild mit einem Intervall von 0,21 μm pro Stack zu erzeugen.
