Detektion von Saccharibakterien in binärer Kultur mittels Polymerase-Kettenreaktion

Zusammenfassung

Quelle: Collins, A. J. et al., Etablierung stabiler binärer Kulturen symbiotischer Saccharibakterien aus der Mundhöhle. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert den Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Nachweisung von Saccharibakterien in einer binären Kultur mit Actinomyces. Das Protokoll beschreibt DNA-Amplifikation und Gelelektrophorese, um eine stabile Wirts-Parasiten-Interaktion zu bestätigen.

Protokoll

1. Saccharibakterien-Infektion per PCR bestätigen
   1. Nach 5 Durchgängen wird die Infektion mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bestätigt. Fünf Durchgänge stellen sicher, dass alle nicht wachsenden Saccharibakterienzellen mit 25 Zyklen PCR über den Nachweisgrenze hinaus erschöpft sind.
   2. Bereite einen PCR-Mastermix vor. Ein empfohlenes Rezept lautet: Für jede benötigte Röhre bereiten Sie 12,5 μL 2x PCR-Puffer, 0,75 μL 10 μM Vorwärtsprimer (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM Rückwärtsprimer (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCCT CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl_{2, und 9} μL Wasser. Mischen Sie durch Vortexen.
   3. Aliquot 24 μL Master mischt in eine 0,2 mL PCR-Röhre. Fügen Sie der PCR-Reaktion 1 μL Saccharibakterien-infizierte Kultur hinzu. Setzen Sie das Rohr in einen Thermocycler und führen Sie folgendes Protokoll durch: Erste Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, 25 Zyklen à 95 °C für 30 S, 60 °C für 30 S, 72 °C für 30 S, abschließende Verlängerung bei 72 °C für 2 Minuten, dann Halt bei 4 °C.
   4. Laden Sie die PCR-Produkte in einem 1%igen Agarose-Gel ein und führen Sie es durch. Ein Band von ~600 Basen weist auf das Vorhandensein von Saccharibakterien hin.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Brain Heart Infusion Broth (dehydriertes Pulver)	Becton-Dickinson	211059	Oder andere Wachstumsmedien, die für Zielorganismen geeignet sind
Elektrophorese-Stromversorgung	Bio-Rad	1645052
Elektrophorese-Rig	Bio-Rad	1704467
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf	950040025	Oder ein gleichwertiger Thermocycler für PCR
MgCl₂-Lösung 25mM	Promega	A3513
Molekularbiologisches Wasser	Fisher Scientific	BP2819100
P-1000 Mikropipette	Gilson	F123601G
PCR-Röhren 0,2 mL	Fisher Scientific	14-230-205
Pipettenspitzen – 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
SYBR Safe DNA-Gel-Färbung	ThermoFisher Scientific	S33102
Tryptische Sojabrühe (getrocknetes Pulver)	Becton-Dickinson	211825	Oder andere Wachstumsmedien, die für Zielorganismen geeignet sind