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HINWEIS: Während des gesamten Experiments werden Makrophagenzellen bei 37 °C in einem 5%igen CO2-Zwangsluftinkubator inkubiert und nur für experimentelle Manipulationen aus dem Inkubator entnommen, die in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt werden. Die Zusammenarbeit mit Listeria monocytogenes Bakterien erfolgt gemäß den Vorschriften der biologischen Sicherheitsstufe 2.
1. Zellvorbereitung und bakterielle Infektion (Tage 1 und 2)
- Tag 1
- Samen 2,0 x 10 7 Knochenmark-abgeleitete Makrophagenzellen (BMDM) auf einer 145 mm großen Schale in 30 ml BMDM + Pen-Streptokokken-Medien (Tabelle 2). Säe 3 Platten für jeden zu analysierenden Bakterienstamm aus. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C in einem 5%igen CO2-Inkubator.
- Beginnen Sie über Nacht mit einer Bakterienkultur des Wildtyps (WT) L. monocytogenes Stamms 10403S in 10 ml Hirn-Herz-Infusionsmedium (BHI) bei 30 °C in einem Standardinkubator. Platziere die Kulturröhren schräg, ohne zu schütteln.
HINWEIS: Diese Wachstumsbedingungen erhöhen die Expression der Flagellengene, was eine effiziente Infektion fördert.
- Tag 2
- Vorwarmes BMDM-Medium (ohne Pen-Streptokokken-Antibiotika) (Tabelle 2) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 37 °C.
- Waschen Sie die Makrophagen-Monoschicht zweimal mit 25 ml vorgewärmtem PBS, um Antibiotika zu entfernen. Füge 30 ml frisches BMDM Medium hinzu.
- Waschen Sie 1,5 ml Bakterienkultur über Nacht mit PBS, indem Sie Bakterien bei > 14.000 x g für 1 Minute zentrifugieren, das Supernatant entsorgen und die Bakterien sanft in 1,5 ml PBS durch Pipettieren wieder suspendieren. Wiederhole das zweimal.
- Infizieren Sie jede Makrophagenplatte mit 0,5 ml einer über Nacht gewaschenen Kultur von Wildtyp-L. monocytogenes. Wenn du mehrere Platten benutzt, infiziere jeden Teller im Abstand von 15 Minuten. Dieses Zeitintervall ermöglicht es, jeden Teller am Ende der Infektion einzeln zu ernten.
HINWEIS: Die Multiplizität der Infektion (MOI) wird durch das Plattieren von seriellen Verdünnungen der Bakterienkultur, die für die Infektion auf BHI-Agarplatten verwendet wird, und durch das Zählen der Koloniebildungseinheiten (CFU) nach 24 Stunden Inkubation der Platten bei 37 °C untersucht. Die Verwendung von 0,5 ml WT L. monocytogenes Stamm 10403S ergibt ein MOI von ~ 100 (100 Bakterien CFU pro Makrophagenzelle). Bei der Analyse bakterieller Mutanten, die im intrazellulären Wachstum defekt sind, sollte ein höheres MOI in Betracht gezogen werden. - Nach 0,5 Stunden Inkubation bei 37 °C werden die infizierten Zellen zweimal mit PBS gewaschen, um losgelöste Bakterien zu entfernen, und 30 ml vorgewärmtes BMDM-Medium hinzugefügt. Anhaftete Bakterien verinnerlichen sich innerhalb der nächsten 0,5 Stunden.
- Eine Stunde nach der Infektion fügen Sie 30 μl Gentamicin (1:1.000) hinzu, um eine Endkonzentration von 50 μg/ml zu erreichen, um extrazelluläre Bakterien abzutöten.
- Bauen Sie das Filtergerät zusammen, indem Sie einen Filterkopf auf eine Sammelflüssigkeitsflasche mit einem Vakuumauslassanschluss setzen. Dann setzen Sie einen Filter (0,45 μm) auf einen Filterkopf, gefolgt von einem Flaschentrichter, und sichern die verschiedenen Teile mit einer Metallklemme. Bereite eiskaltes, RNase-freies Wasser vor.
- 6 Stunden nach der Infektion entnehmen Sie Bakterien aus infizierten Zellen wie folgt. Behandle jeden Teller einzeln.
HINWEIS: In der Regel vollendet L. monocytogenes 1-log Wachstum während einer 6-stündigen Infektion in Makrophagenzellen. Längere Inkubationen könnten zu bakteriellem Überwuchern und Zelltod der Makrophagen führen, während kürzere Inkubationszeiten zu deutlich geringeren bakteriellen Belastungen führen könnten. Das MOI und der Infektionszeitpunkt können angepasst werden, um optimale Bedingungen zu erreichen.- Wasche infizierte Zellen einmal mit PBS. Fügen Sie 20 ml eiskaltes RNase-freies Wasser hinzu, um die Makrophagenzellen zu lysieren. Mit einem Zellschaber kratzen Sie die Zellen schnell, aber vorsichtig von der Platte.
- Sammeln Sie die lysierten Zellen in einem 50-ml-konischen Rohr. Vortex für 30 Sekunden. Zentrifugiere bei 800 x g für 3 Minuten bei 4 °C.
- Leiten Sie das Überdachungsmittel mit einem Vakuumsystem durch das Filtersystem. Mit einer Pinzette rollt man den Filter aus und überträgt ihn schnell in ein 15 ml konisches Rohr. Die Rohre mit den Filtern in flüssigem Stickstoff einfrieren.
- Für die nächste Probe bauen Sie die Filtrationsvorrichtung mit einem neuen Filter zusammen, wie in 1.2.7 beschrieben.
- Lagere die gefrorenen Filter für den nächsten Tag bei -80 °C. Alternativ können Sie direkt zur Nukleinsäureextraktion übergehen.
Tabelle 1: DNase-Reaktionsprotokoll.
| RNA | bis zu 2 μg (bei maximalem Volumen von 44 μl) |
| 10x DNase-Puffer | 5 μl |
| RNase-freies Wasser | vollständig bis 50 μl Gesamtvolumen |
| DNAse | 1 μl (1 Einheit) |
Tabelle 2: Rezepte von Medien und Puffern.
| 1. 500 ml BMDM+Pen-Streptokokken-Medium (Filter sterilisiert): | |
| Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM) | 235 ml |
| Fetales Rinderserum (FBS) (inaktiviert 30 Minuten bei 54 °C) | 100 ml |
| Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor oder M-CSF (L-929-konditioniertes Medium) | 150 ml |
| Glutamin | 5 ml |
| Natriumpyruvat | 5 ml |
| β-Mercaptoethanol | 0,5 ml |
| Penicillin/Streptomycin | 5 ml |
| Gesamt | 500 ml |
| 2. 500 ml BMDM (Filter sterilisiert): | |
| DMEM | 235 ml |
| FBS (inaktiviert 30 Minuten bei 54 °C) | 100 ml |
| M-CSF (L-929 konditioniertes Medium) | 150 ml |
| Glutamin | 5 ml |
| Natriumpyruvat | 5 ml |
| β-Mercaptoethanol | 0,5 ml |
| Gesamt | 500 ml |
| 3. AE-Puffer | |
| Natriumacetat (NaOAc) pH 5,2 | 50 mM |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | 10 mM |
| RNase-freies Wasser | |
| 4. Phenol-Chloroform-IAA | |
| Phenol | 25 ml |
| Chloroform | 24 ml |
| Iso-Amylalkohol | 1 ml |
| 5. Chloroform-IAA | |
| Chloroform | 24 ml |
| Iso-Amylalkohol | 1 ml |