RNA-Extraktion aus Listeria monocytogenes , die aus infizierten Maus-Makrophagen gewonnen wurden

Zusammenfassung

Quelle: Sigal, N., et al. RNA-Reinigung aus intrazellulär gezüchteten Listeria monocytogenes in Makrophagenzellen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert die RNA-Extraktion aus Listeria monocytogenes , die aus infizierten Maus-Makrophagen isoliert wurden. Das Protokoll konserviert RNA, lysiert Zellen mittels Phenol-Chloroform und Wärme und trennt RNA durch Zentrifugation. Salz und Ethanol, kombiniert mit der Kaltinkubation, fördern die RNA-Ausfällung. Die resultierende RNA erfasst die vom Wirt induzierte Genexpression und offenbart so bakterielle Virulenz und Anpassungsstrategien.

Protokoll

1. Nukleinsäureextraktion

HINWEIS: Führen Sie alle Manipulationen mit Phenol- und Chloroformlösungen in einer Dampfhaube durch.

1. Bereiten Sie eine 1:1-Mischung aus gesäuertem Phenol: Chloroform, 400 μl pro Probe vor. Mischen Sie in separaten Röhren und entziehen Sie dann die resultierende wässrige Schicht durch Aspiration. Fügen Sie 40 μl 10% SDS hinzu.
2. Tauen Sie die filterhaltigen Röhren auf Eis auf, um sie kalt zu halten. Jedem filterhaltigen Rohr werden 650 μl Acetat-EDTA (AE) Puffer hinzugefügt (50 mM NaOAc pH 5,2, 10 mM EDTA, RNase-freies Wasser).
3. Führen Sie die folgenden Schritte so schnell wie möglich aus.
   1. Das Rohr mit dem Filter energisch vortexen lassen, sodass der Filter an den Rand des Rohrs schlägt und der Puffer den Filter vollständig wäscht. Halte den Schlauch immer kalt, indem du ihn wieder auf Eis stellst.
      HINWEIS: Es kann notwendig sein, das Rohr im umgekehrten Zustand zusätzlich vortexieren zu lassen, um die Bakterien vollständig vom Filter zu entfernen.
   2. Wiederhole das für alle Röhren. Es kann hilfreich sein, die Federung am Ende des Vorgangs kurz herunterzudrehen (1 Minute bei 120 x g).
4. Übertragen Sie den bakterienhaltigen Puffer in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr, das das SDS und die Phenol/Chloroform-Mischung enthält. Wiederhole das für alle Röhren. Es kann notwendig sein, die filterhaltigen Röhrchen (1 Minute bei 120 x g) erneut zu drehen, um einen Restpuffer aus dem Filter zu erhalten.
5. Setze alle 1,5-ml-Röhren in ein Mehrrohr-Vortex-Gerät und wirbel mit voller Geschwindigkeit 10 Minuten lang.
6. Inkubieren Sie die Röhren 10 Minuten in einem 65 °C Heizblock. Zentrifugiere mit Höchstgeschwindigkeit (> 14.000 x g) für 5 Minuten.
7. Übertragen Sie die wässrige Schicht (etwa 400 μl) aus jedem Röhrchen in ein neues 1,5 ml Rohr, das 40 μl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 1,0 ml 100 % Ethanol enthält. Wirbeln Sie jede Röhre gründlich durch.
   HINWEIS: In diesem Schritt kann Glykogen hinzugefügt werden, um die Visualisierung des ausgefällten Pellets zu verbessern.
8. Inkubieren Sie die Proben bei -80 °C für 1 Stunde. Alternativ können Sie Proben über Nacht bei -20 °C inkubieren. Anschließend wird die Proben bei 4 °C für 20 Minuten mit maximaler Geschwindigkeit (> 14.000 x g) zentrifugiert.
9. Saugen Sie vorsichtig das Ethanol (obere Schicht) aus jedem Rohr ab. Fügen Sie 500 μl kaltes 70%-Ethanol zu jeder Probe hinzu und wirbeln Sie gründlich vor. Zentrifugieren Sie bei 4 °C für 20 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit (> 14.000 x g).
10. Saugen Sie vorsichtig das Ethanol aus jedem Rohr ab. Trocknen Sie die Proben etwa 2 Minuten lang mit einem Vakuumverdampfer ohne Wärme. Trocknen Sie die Proben nicht zu sehr.
11. Fügen Sie jeder Probe 25 μl RNase-freies Wasser hinzu. 20 Minuten bei Zimmertemperatur bebrüten. Vorsichtig Vortex und Spin-down.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Listeria monocytogenes 10403S
H2O, RNAse-frei	Thermowissenschaftlich	10977-015	DEPC-behandeltes Wasser kann verwendet werden
Phenolgesättigter pH-Wert 4,3	Fisher	BP1751I-400
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Iso-Amylalkohol	Sigma-Aldrich	W205702
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
SDS 10 %	Sigma-Aldrich	L4522
Ethanol-Absoluter	Merck Millipore	1070174000
MF-Millipore-Filter 45 mm, 0,45 μm	Merck Millipore	HAWP04700
Vortex-Genie 2	Wissenschaftliche Industrien	Modell G560E
65 °C Wärmeblock	Thermowissenschaftlich
4 °C Tischzentrifuge	Eppendorf	5417R
Sterile Pipetten, 25 ml	Greiner
Falkenröhren, 50 ml	Greiner
1,7 ml Röhren, frei von RNase	Axygen	MCT-175-C
SpeedVac-System	Thermowissenschaftlich	SPD131DDA