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Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.
1. Uropathogene Escherichia coli (UPEC) bakterielle Inokulumpräparation
- Bereite Harnwegsinfektionen89 (UTI89) Inokulum vor (Beginn 72 Stunden vor dem Impftag)
- Striche UTI89 auf eine LB (Luria-Bertani) Agarplatte aus einem gefrorenen Fond. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C. Wählen Sie eine Kolonie aus und impfen Sie sie in 10 ml LB in einer 125-ml-Flasche. Inkubiere bei 37 °C für 24 Stunden, statisch.
- Inokulieren Sie 10 μl Kultur über Nacht in 10 ml LB in einer neuen 125-ml-Flasche für weitere 24 Stunden bei 37 °C, statisch.
- Übertragen Sie 3 ml (variiert je nach Stamm und gewünschter Inokulumgröße) in sterile 1,5-ml-Röhren, zentrifugieren Sie bei 7.000 x g für 3 Minuten, wobei das Pellet in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) erneut suspendiert wird und ein zweites Mal zentrifugiert wird. Das bakterielle Pellet in 1 ml 1x PBS wieder suspendieren.
- Messung der optischen Dichte von Bakterien und Anpassung der Konzentration an die gewünschte Inokulumdichte. Die Standardkonzentration des verwendeten Inokulums beträgt 107Bakterien ; Dies kann jedoch je nach Studienausrichtung variieren.
2. Bakterielle Impfung
- Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70 % Ethanol und bedecken Sie den Bereich mit saugfähigem Papier (oder verwenden Sie eine sterile Flusshaube).
- Nehmen Sie bis zu 0,9 ml des vorbereiteten bakteriellen Inokulums in eine 1 ml Tuberkulinspritze (TB) (Luftblasen entfernen). Befestigen Sie eine vorbereitete sterile Inokulationsnadel mit Polyethylen mit der Größenbezeichnung 10 (PE10) Schlauch an die Spritze mit dem Inokulum und schneiden Sie den Polyethylenschlauch dann steril ab.
HINWEIS: Lassen Sie 1 mm Schlauch oberhalb der Nadelspitze liegen, um eine Blasenöffnung zu vermeiden. - Schneiden Sie ein 2,5 cm großes Stück Parafilm ab und geben Sie einen Klecks chirurgisches Gleitmittel (ungefähr so groß wie ein Groschen) obendrauf.
- Betäuben Sie weibliche C3H/HeN-Mäuse, indem Sie sie in eine Verdampferkammer legen (gemäß dem Protokoll des Herstellers), bis sie bewusstlos sind, aber noch normal atmen (1 Atemzug/Sekunde).
VORSICHT: Isofluran ist ein Inhalationsanästhetikum. Verwenden Sie sie in einem gut belüfteten Bereich und minimieren Sie das Einatmen. - Nimm die Maus aus dem Verdampfer, lege sie auf den Rücken auf ein Papiertuch und spreize die Beine.
- Bedecken Sie die Nase der Maus mit einem Nasenkegel (einem Rohr, das mit dem Verdampfer verbunden ist und eine kontrollierte Isofluran-Dosis liefert, die bei einigen Verdampfergeräten enthalten ist), um die Betäubung aufrechtzuerhalten.
- Lassen Sie die Blase vorsichtig abtasten, um das Wasserlassen zu induzieren und sicherzustellen, dass die Blase entleert ist. Wischen Sie den periurethralen Bereich mit einem 100%igen Ethanol-Tuch ab. Tupfen Sie die Impfnadel/Spritze, mit der Spitze voran, in das chirurgische Gleitmittel.
- Inokulieren Sie jede Maus mit 50 μl der Bakterienlösung, indem Sie die Inokulationsnadel transurethral, etwa 12 mm, einführen und sanft auf den Spritzenkolben drücken, um das Inokulum in die Blase zu dosieren (10 μl/s). Entfernen Sie die Impfnadel aus der Maus.
HINWEIS: Das sofortige Rückkehren des Inokulums an der Harnröhrenöffnung beim Beginn der Impfung weist auf eine unsachgemäße oder unvollständige Nadeleinführung hin. - Nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkegel und legen Sie sie zurück in ihren Käfig. Wiederhole die Schritte 2.3-2.8 für jede Maus. Wenn/wenn du die Inokulum-Bedingungen oder -stämme wechselst, entsorge die Spritze und die Impfnadel in einem zugelassenen Behälter mit scharfen Mitteln und fang bei Schritt 2.2 wieder an.
HINWEIS: Eine Impfung mit uropathogenen Organismen verursacht in der Regel keine starken Schmerzsymptome. In seltenen Fällen kann jedoch die Verabreichung großer Dosen von Krankheitserregern Fieber, eine Verringerung der Nahrungs- und Wasseraufnahme sowie abnormales Verhalten verursachen. Die Tiergesundheit sollte während des gesamten Experiments überwacht werden. Bei offensichtlichen Schmerzsymptomen kann ein Schmerzmittel wie Buprenorphin (0,05−0,1 mg/kg subkutan) angewendet werden.
3. Intrazelluläre Bakteriengemeinschaften (IBC) Enumeration
- Entferne die Blase aseptisch und lege sie in 1x PBS in einer 6-Well-Platte mit Silikonboden. Die Platten können mit einem Silikon-Elastomer-Set vorbereitet werden, wobei etwa 1 cm Silikon in jedes Bohrloch gegossen wird. Schneide die Blase mit einer Schere in zwei Hälften.
- Mit kleinen Metallstiften spreizen Sie die Blase vorsichtig, sodass das Blasenlumen nach oben zeigt. Stellen Sie sicher, dass Sie die Nadeln an den äußersten Rändern der Blasenabschnitte platzieren, um die maximale Menge an Urothel freizulegen.
- Nach dem Spreing waschen Sie die Blase vorsichtig einmal mit 1x PBS. Entfernen Sie das 1x PBS per Pipette. Repariere die Blase, indem du genug 3% Paraformaldehyd hinzufügst, um die gesamte gespreizte Blase zu bedecken.
VORSICHT: Paraformaldehyd ist krebserregend. Geeignete Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, sollte jederzeit getragen werden. Die Entsorgung sollte den institutionellen Richtlinien folgen. - Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Entferne die Paraformaldehydlösung. Waschen Sie einmal mit 1x PBS.
- Waschen Sie mit LacZ-Waschlösung (2 mM MgCl2, 0,01 % Natriumdesoxycholat und 0,02 % Nonidet-p40 in 1x PBS) dreimal für 5 Minuten pro Wasch.
- Entfernen Sie die Waschlösung und fügen Sie genügend LacZ-Fleck hinzu (9,5 ml LacZ-Waschlösung, 0,4 ml 25 mg/ml X-gal und 0,1 ml 100 mM K-Ferrocyanid/K-Ferricyanid), um die Blase zu bedecken. Inkubieren Sie über Nacht bei 30 °C, geschützt vor Licht.
- Entfernen Sie gespreizte Blasen aus dem Inkubator und beobachten Sie IBCs, die als blaue Puncta erscheinen, wie sie mit einem Seziermikroskop mit 40-60-facher Vergrößerung dargestellt werden.
HINWEIS: Manchmal kann eine Maus urinieren, bevor die Tube unter die Harnröhre gelegt wird. In diesem Fall warten Sie 15–20 Minuten, bevor Sie erneut versuchen, Urin zu sammeln.