Agrobakterienvermittelte Abgabe rekombinanter viraler Klone in Maissetzlinge zur Gen-Silencing

Zusammenfassung

Quelle: Beernink, B. M. et al. Direkte Agroinokulation von Maissetzlingen durch Injektion mit rekombinanten Fuchsschwanzmosaikvirus- und Zuckerrohrmosaikvirus-infektiösen Klonen. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert die durch Agrobacterium vermittelte Abgabe rekombinanter viraler Klone in Maissetzlinge zur Gen-Silencing. Es beschreibt den Prozess der Agrobacterium-Infektion , systemische virale Ausbreitung und phänotypische Veränderungen durch RNA-Interferenz.

Protokoll

1. Injektion
HINWEIS: Maissetzlinge ab 4 bis 7 Tagen können zur Injektion verwendet werden. Die Wachstumsrate der Sämlinge wird stark von Wachstumsbedingungen, der Menge an photosynthetisch aktiver Strahlung (PAR) (d. h. höherem PAR im Gewächshaus als in der Wachstumskammer) und dem Genotyp beeinflusst, neben anderen Dingen, die unter Gewächshausbedingungen schwer zu kontrollieren sind. Pflanzen können bereits ab 4 Tagen injiziert werden, wenn sie 2–3 cm hoch sind und keine Blätter ausgedehnt haben, und ab 7 Tagen, wenn das unterste abgerundete Blatt ausgeweitet ist. Die Erfolgsrate dieser Impfmethode sinkt rapide, da die Pflanzen nach der Aussaat über 7 Tage hinaus altern. Die Injektionsstelle ist unabhängig vom Alter der Setzlinge gleich.

1. Tragen Sie eine Schutzbrille und injizieren Sie die bakterielle Suspension mit einer 25G x 5/8" Nadel, die an einer 1-mL Einwegspritze befestigt ist, in die Setzlinge 2–3 mm oberhalb des Coleoptilar-Knotens.
   HINWEIS: Der Coleoptilarknoten ist der Ort, an dem sich schließlich Kronenwurzeln bilden. Das ist der unterste Knoten der Anlage. Typischerweise gibt es einen Farbwechsel von Grün zu Weiß an und unterhalb des Knotens. Die Injektionsstelle befindet sich direkt über dem Meristem. Das Zerlegen einiger Setzlinge in diesem Stadium kann helfen, die Position des Meristems zu visualisieren und somit die richtige Injektionsstelle.
2. Üben Sie sanften Druck auf die Spritze aus, bis die Suspension das Coleoptil füllt oder im Wirbel sichtbar ist, je nach Wachstumsstadium der Pflanzen. Das entspricht etwa 100–200 μL Aufhängung.
   HINWEIS: Wenn es schwierig ist, die Suspension in den Sämling zu injizieren, kann die Injektionsstelle zu niedrig sein. Moderater Druck reicht aus, um die Federung einzuspritzen.
3. Injiziere alle Setzlinge, wechsle Spritzen und Nadeln für jedes Konstrukt.

2. Kontinuierliche Pflanzenpflege

1. Pflanzen Sie die injizierten Setzlinge in Töpfe von 13 x 13 x 15 cm oder größer, wenn sie 7-8 Tage alt sind.
2. Pflege der Wachstumsbedingungen (16 Stunden Photoperiode und einmal pro Woche Düngen).

3. Bestätigung der Infektion (phänotypisch)

1. Phänotypisch bewerten Pflanzen zwischen 14 und 21 Tagen nach der Impfung (DPI). Läsionen durch das Abschalten der Kontrollgene wie Läsion mimic 22 oder Phytoen-Desaturase sind leicht auf den Blättern sichtbar und unterscheiden sich von den FoMV-Symptomen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-mL-Spritzen	Fisher Scientific	14955450	alternativ BD 309659
Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101			Führt Vir-Plasmid, das für T-DNA-Transfermaschinen kodiert, RifR, GmR, aus dem Labormaterial
Dünger			Peters Dünger 15-15-15-Konzentrat
Große Töpfe	Kordlok	SQL0550	5x5x4" oder größer. Zum Umpflanzen von Setzlingen.
Mais-Gold-Bantam-Süßmaissamen	American Meadows, West Coast Seeds
Bodensubstrat	SunGro Gartenbau	SS#1-F1P	Sunshine Mix #1/Fafard-1P, jede Bodenmischung, in der Mais gut wächst, reicht aus