Etablierung von bakteriellen und pilzreichübergreifenden Biofilmen zur Untersuchung oraler Pathogenese

Zusammenfassung

Quelle: Schlafer, S, und Frost Kristensen, M. Überwachung des extrazellulären pH-Werts in Reichsübergreifenden Biofilmen mittels Konfokalmikroskopie. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video demonstriert die Kultivierung von Streptococcus mutans- und Candida albicans-Reichs-Biofilmen unter oralähnlichen Bedingungen, um bakteriel-pilz-Interaktionen zu modellieren und so die Untersuchung mikrobieller Synergie, glucanvermittelter Adhäsion und acidogener Virulenz in der oralen Pathogenese zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden gemäß den Richtlinien des IRB des Instituts durchgeführt.

1. Kultivierung von biofilmübergreifenden Reichen

1. Streptococcus mutans (S. mutans) DSM 20523 und Candida albicans (C. albicans) NCPF 3179 auf Blutagarplatten bei 37 °C unter aeroben Bedingungen wachsen lassen.
2. Einzelne Kolonien jedes Organismus werden in Reagenzgläser übertragen, die mit 5 ml Herzinfusion (BHI) gefüllt sind. Wachsen Sie 18 Stunden unter aeroben Bedingungen bei 37 °C.
3. Zentrifugiere die Kulturen über Nacht bei 1.200 x g für 5 Minuten. Entsorgen Sie das Supernatant, legen Sie die Zellen in physiologischer Kochsalzlösung wieder auf und stellen Sie den OD_{550 nm} auf 0,5 für C. albicans (~10⁷ Zellen/mL) und S. mutans (~10⁸ Zellen/mL) an. Verdünnen Sie die S. mutans-Suspension 1:10 mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (~10⁷ Zellen/mL).
4. Pipette 50 μL sterile Speichellösung in die Bohrlöcher einer optischen unteren 96-Bohrloch-Platte zur Mikroskopie. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 °C. Waschen Sie die Brunnen dreimal mit 100 μL steriler physiologischer Kochsalzlösung. Leere die Brunnen.
5. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL C. albicans-Suspension hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C für 90 Minuten. Wasche dreimal mit steriler physiologischer Kochsalzlösung.
   HINWEIS: Entleeren Sie die Brunnen beim Waschen nicht vollständig. Lassen Sie ein Reservoir von 20 μL, um übermäßige Scherkräfte zu vermeiden.
6. Fügen Sie jedem Brunnen 100 μL hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (bei 56 °C für 30 Minuten inaktiviert) hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C für 2 Stunden. Wasche dreimal mit steriler physiologischer Kochsalzlösung. Entleeren Sie die Brunnen, sodass ein Reservoir von 20 μL bleibt.
7. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL S. mutans-Suspension (vorbereitet in Schritt 1.3) hinzu. Fügen Sie 150 μL BHI mit 5 % Saccharose hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C für 24 Stunden oder länger. Wenn Sie ältere Biofilme kultivieren, wechseln Sie das Medium täglich auf frisches BHI. Am Ende der Cross-Kingdom-Biofilm-Wachstumsphase sollte man fünfmal mit steriler physiologischer Kochsalzlösung waschen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Blutagarplatten	Statens Serum Institut	677
Herzinfusion im Gehirn	Oxoid	CM1135
Herzinfusion im Gehirn + 5 % Saccharose	BDH-Labormaterial	10274
Candida albicans	Nationale Sammlung pathogener Pilze	NCPF 3179
Fetales Rinderserum	Gibco Life Technologien	10270
GS-6R Kühlzentrifuge	Beckman	N/A
μ-Plate 96 Well Black	Ibidi	89626
Sterile physiologische Kochsalzlösung	VWR	6404
Streptococcus mutans	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
Vis-Spektrophotometer V-3000PC	VWR	N/A