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1. Siliziumwafer-Vorbereitung
- Entwerfen Sie die Geometrien des mikrofluidischen Kanals in Computer-Aided Design (CAD; siehe Materialtabelle) und drucken Sie sie auf einen transparenten Film, um die Fotomaske zu erstellen (Abbildung 1A).
- Fertigen Sie die Masterform mit weicher Lithografie (unter Reinraumbedingungen) nach den folgenden Schritten an.
- Backe die Siliziumwafel bei 200 °C 2 Stunden lang.
- Platziere den Wafer in die Mitte eines Spincoaters und gieße SU8 3050 Photoresist (siehe Materialtabelle) auf den Wafer. Spinnmantel bei 1.700 U/min für 40 Sekunden mit einer Rampenzeit von 10 s/100 U/min.
HINWEIS: Die Spin-Beschichtungsparameter wurden so eingestellt, dass eine Zieldicke von 100 μm für den SU8 3050 erreicht wurde. - Nach dem Spin-Coating-Prozess wird der Siliziumwafer bei 65 °C für 600 Sekunden und 95 °C für 2.700 Sekunden weich gebacken. Lass den Wafer über Nacht bei Zimmertemperatur abkühlen.
HINWEIS: Die nächtliche Kühlung verbessert die Haftung des SU8 am Wafer. - Setzen Sie die Fotomaske (Schritt 1.1) auf den Wafer und besetzen Sie sie UV-Licht, mit einer Belichtungsenergie von 250 mJ/cm² und einer Wellenlänge von 350 nm.
- Nach der Belichtung backen Sie das belichtete Substrat bei 65 °C für 60 Sekunden und 95 °C für 300 Sekunden.
- Entwickeln Sie den Siliziumwafer, um die Masterform zu erhalten, indem Sie ihn in einen Becher tauchen, der mit mrDev600-Entwickler gefüllt ist (siehe Materialtabelle). Schüttle den Becher vorsichtig 1.800 Sekunden, um den unpolymerisierten Resist auszuwaschen. Anschließend spritzt man Isopropanol auf den Siliziumwafer und trocknet an der Luft.
- Hartbacken Sie den Siliziumwafer bei 200 °C für 1.800 Sekunden.
- Silanisieren Sie die Hauptform durch die Dampfabscheidung von 20 μL Trichloro-Silan (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) Silan (siehe Materialtabelle), das 40 Minuten lang auf einem Glasobjektträger neben der Form in einem Vakuumaustrockner aufgetragen wird, wodurch ein Druck von 100 mbar entsteht.
2. Herstellung des mikrofluidischen Bauteils
HINWEIS: Das hier beschriebene Herstellungsverfahren gilt für ein mikrofluidisches Gerät mit einem mikrofluidischen Kanal. Dennoch kann dieselbe Methode angewendet werden, um ein mikrofluidisches Gerät mit mehreren mikrofluidischen Kanälen parallel herzustellen.
- Mischen Sie das Elastomer mit seinem Quervernetzer im Verhältnis 10:1 (siehe Materialtabelle), um eine Polydimethylsiloxan-(PDMS)-Mischung herzustellen. Rühren Sie die Mischung um, bis sie gleichmäßig vermischt ist und durch die geschlossenen Luftblasen undurchsichtig wird.
- Entfetten Sie das Gemisch in einem Vakuumaustrockner, wodurch ein Druck von 100 mbar entsteht, bis die eingeschlossenen Luftblasen entfernt sind und es transparent aussieht. Die Zeit für die Entgasung beträgt typischerweise 30 Minuten.
- Setzen Sie die Hauptform (Schritt 1) in eine Zellkulturschale (siehe Materialtabelle). Gießen Sie 20 g der PDMS-Mischung auf die Hauptform, um Kanäle mit einer Enddicke von 5 mm zu erzeugen.
- Backe die Hauptform bei 70 °C für 2 Stunden.
- Schneiden Sie das ausgehärtete PDMS um den mikrofluidischen Kanal (in etwa 3 mm Abstand) mit einer Klinge und ziehen Sie dann den PDMS-Mikrofluidikkanal von der Hauptform ab.
- Um Ein- und Auslass der mikrofluidischen Kanäle zu schaffen, werden Löcher mit einer Biopsiestanze (Durchmesser 1,5 mm) an den Enden (oben an den Dreiecken, siehe Abbildung 1A) gestanzt. Stanzen Sie ein zusätzliches Loch in der Mitte des Einlassdreiecks, um später den Drucksensor einzubauen.
- Waschen Sie einen Glasträger und den mikrofluidischen Kanal 5 Minuten lang mit einer handelsüblichen 1%-Reinigungslösung (siehe Materialtabelle) und spülen Sie sie dann mit deionisiertem Wasser ab. Waschen Sie anschließend den PDMS-Mikrofluidikkanal und den Glasschlitten mit Isopropanol. Dann spülen Sie sie erneut mit deionisiertem Wasser ab. Trockne den PDMS-Mikrofluidikkanal und den Glasschlitten mit Druckluft bei 1 bar für 1 Minute.
HINWEIS: Die poröse Struktur des PDMS muss vollständig trocken sein, damit die Bindung wirksam ist. - Legen Sie den Glasträger und den mikrofluidischen Kanal in einen Plasmareiniger (siehe Materialtabelle) und stellen Sie sicher, dass die zu verbindenden Flächen nach oben zeigen. Schalten Sie den Plasmareiniger ein und behandeln Sie den mikrofluidischen Kanal und den Glasschlitten mit Luftplasma bei einem Luftstrom von 1 SL/h (Standardliter pro Stunde) für 1 Minute. Verbinde den mikrofluidischen Kanal direkt nach dem Entfernen aus dem Reiniger mit dem Glasobjekt, indem du sie miteinander in Kontakt bringst.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die behandelten Oberflächen nicht zu berühren, da dies die Bindung beeinträchtigen könnte. Beim Bau eines mikrofluidischen Bauteils mit mehreren mikrofluidischen Kanälen werden die mikrofluidischen Kanäle gleichzeitig belichtet und in einem einzigen Schritt verbunden. - Stellen Sie das verbundene mikrofluidische Gerät für mindestens 15 Minuten auf eine 80 °C heiße Platte.
- Bewahren Sie das Mikrofluidikgerät in einer sauberen Zellkulturschale auf, bis das Experiment beginnt.
3. Herstellung der bakteriellen Suspension
- Wachsen Sie eine Population von Bacillus subtilis NCIB 3610 für 20 Stunden vor Beginn des Experiments, indem Sie direkt 3 ml Nährstoffbrühe Nr. 3 Kulturmedium (siehe Materialtabelle) aus einem gefrorenen Glycerolfond in einem 15-ml-Kulturrohr inokulieren. Inkubieren Sie nachts in einem schüttelnden Inkubator bei 30 °C und 200 U/min (16 Stunden lang).
- Machen Sie 4 Stunden vor Beginn des Experiments eine Subkultur aus der Übernachtkultur, indem Sie 3 μL der Übernachtkultur in 3 ml Frischkulturmedium (1:1.000 Verdünnung) in einem 15-mL-Kulturrohr hinzufügen. Inkubieren Sie die Subkultur in einem schüttelnden Inkubator bei 30 °C bei 200 U/min für 3,5–4 Stunden, um eine optische Dichte von 0,1 bei 600 nm (OD₆₀₀) zu erhalten.
4. Biofilm-Wachstumsexperiment
- Schalten Sie den Inkubator des Mikroskops 3 Stunden vor dem Experiment ein, um eine stabile Temperatur von 25 °C sicherzustellen. Installieren Sie die Spritzenpumpe und die Drucksensoren (siehe Materialtabelle).
- Verbinden Sie den Ein- und Auslassschlauch mit dem mikrofluidischen Gerät. Führen Sie direkt eine Nadel (mit einem Außendurchmesser von 0,6 mm) in das Einlassrohr ein, um die Verbindung zwischen Schlauch und Spritze zu sichern.
- Setzen Sie das Mikrofluidikgerät, 30 ml deionisiertes Wasser und 30 ml Kulturmedium in einen Vakuum-Desikator und entfetten Sie sie mindestens 1 Stunde lang. Dann zieht man langsam das Kulturmedium und das deionisierte Wasser in zwei separate 30-mL-Spritzen.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um die Bildung von Blasen im Kanal beim Spülen mit dem Kulturmedium zu verhindern. - Installieren Sie das mikrofluidische Gerät am Mikroskop und legen Sie das Auslassrohr in einen Abfallbehälter.
- Verbinden Sie die mit deionisiertem Wasser gefüllte Spritze über den Mikrofluidikschlauch an den mikrofluidischen Kanal und injizieren Sie das Wasser langsam, bis es den Ausgang des Drucksensors verlässt. Füllen Sie den Drucksensor mit Wasser und spülen Sie alle Blasen aus dem Schlauch, der den Mikrofluidkanal mit dem Drucksensor verbindet. Schließe den Auslass des Drucksensors mit den Schrauben, die dem Drucksensor zugeordnet sind.
HINWEIS: Das beschriebene Füllverfahren stellt sicher, dass die Druckänderungen am Einlass der mikrofluidischen Kanäle genau erfasst werden. Wenn Sie ein Experiment mit mehreren mikrofluidischen Kanälen durchführen, verbinden Sie jeden Kanal mit einer separaten Spritze, um gleichmäßige Durchflussbedingungen in allen Kanälen zu gewährleisten.
- Füllen Sie den Rest des mikrofluidischen Kanals mit dem deionisierten Wasser.
- Setzen Sie einen 1,2-μm-Filter (siehe Materialtabelle) auf die Kulturmedienspritze. Dann entferne die Wasserspritze und verbinde die Kulturmedienspritze vorsichtig mit dem Einlass-Mikrofluidikschlauch. Die Spritze an der Spritzenpumpe montieren und den Kanal mit dem Kulturmedium mit einer Durchflussrate von 2 mL/h für 1 Stunde spülen.
HINWEIS: Der Filter verhindert, dass Bakterienzellen während des Ladens in die Spritze gelangen. Das Spülen des mikrofluidischen Kanals mit dem Kulturmedium entfernt die verbleibenden Blasen in der porösen Struktur. - Stellen Sie die Spritzenpumpe während des Experiments auf die gewünschte Durchflussrate (hier 1 mL/h) ein und stellen Sie die Druckanzeige der Drucksensoren auf null.
HINWEIS: Indem der Anfangsdruckwert auf null eingestellt wird, wird nur der Druckunterschied gemessen, der während des Experiments durch die Entwicklung von Biofilmen verursacht wird. - Pipettieren Sie 1 ml der Bakterienkultur mit einem OD₆₀₀ von 0,1 in ein 1,5 mL Zentrifugenfläschchen. Füllen Sie die Bakterienkultur in den mikrofluidischen Kanal, indem Sie das Auslassrohr in das Zentrifugenröhrchen legen. Nach 5 Minuten Warten, um mögliche Luftblasen aus dem Ausgang der Röhren zu entfernen, entnehmen Sie 150 μL Bakterienlösung mit einer Durchflussrate von 1 mL/h, bis der Mikrofluidkanal mit der Bakterienkultur gefüllt ist.
- Entferne vorsichtig den Spritzenfilter des Kulturmediums und setze den Auslass in den Abfallbehälter. Lassen Sie die bakteriellen Zellen 3 Stunden unter Null-Fluss-Bedingungen im mikrofluidischen Kanal, damit sich ihre Oberflächenanhaftung im porösen Medium befestigt.
HINWEIS: Das Belassen der bakteriellen Zellen bei 3 Stunden ohne Fluss wurde für die Anhaftung des verwendeten Bakterienstamms optimiert und gleichzeitig eine gut sauerstoffreiche Bakterienkultur gewährleistet. Andere Bakterienstämme benötigen möglicherweise mehr oder weniger Zeit. - Um das Experiment zu starten, starten Sie den Durchfluss, indem Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussrate (hier 1 mL/h) stellen und den Druckabstand bei 1 Hz beginnen.
- Aufnahmen von Bildern des wachsenden Biofilms im gewünschten Zeitintervall, optischer Konfiguration und Vergrößerung.
HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden alle 6 Minuten für 24 Stunden Bilder mit 4-facher Vergrößerung im Hellfeldmodus in 18 Positionen über den gesamten Bereich des porösen Mediums aufgenommen.
