Mikroskopische Bewertung der bakteriellen Anhaftung an Pflanzenwurzeloberflächen

Abstract

Quelle: Matthysse, A. G. Die Haftung von Bakterien an Pflanzenoberflächen, gemessen im Labor. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert die Bewertung der bakteriellen Anhaftung an Pflanzenwurzeln mittels Phasenkontrastmikroskopie. Wurzelproben von mit Bakterien inkubierten Setzlingen werden zunächst montiert, um freie Bakterien zu überprüfen. Die Proben werden dann gewaschen, um lose angesetzte Bakterien zu entfernen, und mit einem geeigneten Deckdeckel wieder montiert, um Schäden zu verhindern. Schließlich wird die Anzahl der an den Wurzelhaaren angehefteten Bakterien unter dem Mikroskop gezählt.

Protocol

1. Impfung der Bakterien

1. Bestimmen Sie die Anzahl der zu impfenden Bakterien unter Berücksichtigung der Messung zur Bestimmung der bakteriellen Adhäsion und der Länge der Inkubationszeit.
2. Für mikroskopische Studien mit Inkubationszeiten von weniger als einem Tag sollten relativ große Mengen von Bakterien geimpft werden. Geben Sie eine bestimmte Menge Kultur, um eine endgültige Bakterienkonzentration von mehr als 10,6 Bakterien pro ml zu erreichen. Bei längeren Inkubationszeiten sollten Sie die Größe des bakteriellen Inokulums verringern.
3. Für Studien, bei denen die bakterielle Adhäsion durch lebensfähige Zellzählungen gemessen wird, wird eine Kulturmenge hinzugefügt, um eine endgültige Bakterienkonzentration von 10,³ bis 106^Bakterien pro ml zu erreichen.
4. Vermeiden Sie es, so viele Bakterien hinzuzufügen, dass deren Stoffwechsel den pH-Wert oder die Sauerstoffkonzentration im Inkubationsmedium verändert. Missen Sie den pH-Wert mit pH-Papier oder einer Elektrode. Messen Sie die Sauerstoffkonzentration mit einer Sauerstoffelektrode.
5. Bei Pflanzen, die in Sand wachsen, sollten Sie auf drei mögliche Arten impfen.
   1. Impfen Sie den Samen vor dem Pflanzen mit den Bakterien, indem Sie die Samen 1 Minute in einer Suspension in Wasser von etwa 10–⁶ Bakterien pro ml einweichen.
   2. Inokulieren Sie die Wurzel durch keimende axenische Setzlinge. Wenn die Wurzel des Sämlings etwa 1 cm lang ist, tauchen Sie sie in oder legen Sie den gesamten Setzling in eine Suspension von 10 bis⁶ Bakterien pro ml in Wasser für 1 Minute.
   3. Inokulieren Sie den Sand, indem Sie die Bakterien vor dem Pflanzen mit dem Sand mischen, um eine Endkonzentration von etwa^10-3 Bakterien pro ml zu erreichen, oder indem Sie den Setzling nach dem Pflanzen mit einer Suspension von 10-6 Bakterien pro ml gießen.

2. Inkubation der Bakterien mit dem Pflanzenmaterial

1. Für die Inkubation in flüssigen Medien wird die Bakterien mit dem Pflanzenmaterial in sterilem Wasser oder Saccharose- und Mineralsalzen oder einem Pflanzengewebekulturmedium (wie etwa einer 1:10-Verdünnung von Murashige- und Skoog-Basalsalsalmischungen oder MS-Salzen) inkubiert.
   1. Verwenden Sie einen Behälter, an dem die Bakterien nicht haften. Versuchen Sie, die Pflanzenoberfläche kontinuierlich abzudecken, entweder durch Untertauchen oder sanftes Rühren. Kräftige Bewegungen können die Haftung verhindern oder sogar Bakterien von der Pflanzenoberfläche entfernen.
   2. Beobachten Sie das Pflanzenmaterial im Lichtmikroskop nach unterschiedlichen Zeitintervallen, um zu bestimmen, wann die Inkubation gestoppt und Messungen vorgenommen werden sollte. Ein Zeitverlauf der Haftung ist oft wertvoll, da Proben alle 1 bis 4 Stunden oder täglich entnommen werden, abhängig von der Geschwindigkeit der Interaktion.
2. Um in Sand zu inkubieren, wenden Sie die gleichen Überlegungen an, die in Schritt 2.1 für die Inkubation in flüssigem Medium beschrieben sind.

3. Messung der Haftung mittels Mikroskopie

1. Führen Sie mikroskopische Messungen mit Nomarski oder Phasenkontrastoptik durch, um die Bakterien auf Oberflächen leicht zu sehen. Allerdings kann jedes Hellfeldmikroskop mit einer Vergrößerung von 20-fach oder höher verwendet werden.
   1. Verwenden Sie mikroskopische Beobachtung, um festzustellen, ob die Bakterien zufällig verteilt sind oder sich an bestimmten Stellen befinden. Überprüfe auch, ob sie einzeln oder in Clustern gebunden sind. Achten Sie auf das Vorhandensein von Mikrokolonien, was auf Bakterienwachstum oder Einklemmung nach der Adhäsion hindeutet. Überprüfe, ob die Bakterien scheinbar einen Biofilm auf der Oberfläche bilden.
      HINWEIS: Ein Biofilm ist eine große Anzahl von Bakterien, die an der Oberfläche gebunden und von einer extrazellulären Matrix umgeben sind. Die Struktur kann glatt und einheitlich sein oder eine komplexere Architektur aufweisen.
   2. Verwenden Sie Bakterien, die mit einem fluoreszierenden Marker markiert sind. Wenn andere Bakterien vorhanden sind und die interessierten Bakterien durch ein fluoreszierendes Etikett wie das grüne fluoreszierende Protein (GFP) identifiziert werden, wird mit einer Fluoreszenzmikroskopie das Vorhandensein der markierten Bakterien in Clustern anderer Bakterien bestimmt. Für GFP verwenden Sie einen Filter mit 490 nm Anregung und 520 nm Emission.
      1. Überprüfen Sie, dass das fluoreszierende Etikett die Bakterien nicht negativ beeinflusst, indem Sie die Haftung einer gleichen Mischung aus Wildtyp-Bakterien und markierten Bakterien desselben Stamms an axenartigem Material mit Nomarski- und Fluoreszenzoptik beobachten. Wenn die fluoreszierenden und dunklen Bakterien zufällig gemischt und in gleicher Zahl vorhanden sind, hat das Etikett den Test nicht beeinträchtigt.
2. Bestimmen Sie die Anzahl der angebundenen Bakterien.
   HINWEIS: Es ist sehr schwierig, die Anzahl der angehefteten Bakterien im Mikroskop zu bestimmen. Wenn die Bindung an unregelmäßige Pflanzenoberflächen erfolgt, ist es in der Regel nicht möglich, eine quantitative Messung zu erhalten. Die Rasterelektronenmikroskopie (in diesem Artikel nicht behandelt) kann für solche Messungen verwendet werden.
   1. Wenn die Bakterien an eine glatte Oberfläche, wie ein Wurzelhaar, gebunden sind, zählen Sie die Anzahl der Bakterien, die am Rand des Wurzelhaars gebunden sind, pro Millimeter Wurzelhaarlänge. Achte darauf, Wurzelhaare ungefähr gleicher Größe und Form zu verwenden, um die Maße zu vergleichen.
   2. Um die Größe der Objekte im Mikroskop zu bestimmen, verwenden Sie einen kommerziellen Objektträger mit gemessenen Markierungen. Beobachten und fotografieren Sie diesen Dia unter denselben Einstellungen wie für das experimentelle Material und verwenden Sie die resultierenden Bilder, um die Größe der Objekte in den Fotomikrographen zu bestimmen.
3. Bereiten Sie die Probe für die Mikroskopie vor.
   1. Waschen Sie die Probe. Bringen Sie die Probe auf einen Wassertropfen oder ein Inkubationsmedium auf einem Objektträger und beobachten Sie sie direkt.
      HINWEIS: Dies hat den Vorteil, dass es ohne Bakterienwachstum oder tatsächlichen Bakterientod wahrscheinlich kaum freie Bakterien gibt. Betrachte das Fehlen freier Bakterien als Warnzeichen, dass es möglicherweise einen bakteriellen Tod oder eine Bindung an den Behälter gab, in dem die Inkubation stattfand. Der Effekt des Waschens der Probe ist in Abbildung 1 dargestellt.
   2. Waschen Sie die Probe vorsichtig in Wasser oder Inkubationsmedium, indem Sie sie in ein Fläschchen mit Flüssigkeit legen und das Fläschchen vorsichtig umkehren. Dann legen Sie die Probe auf den Objektträger in frischer Flüssigkeit zur Beobachtung.
   3. Die Probe wird in Flüssigkeit mit einem gewöhnlichen Deckmantel und einem Mikroskop-Objektträger montiert.
      1. Wenn die Probe dick ist und dadurch eine Wölbung unter dem Deckungsschleifer entstehen würde, verwenden Sie einen Press-Apply-Deckelzettel. Diese Überdeckungsschläfer haben einen Ring aus Gummi oder Kunststoff um den Rand des Deckels. Lege die Flüssigkeit und die Probe in den Schacht im Deckel, dann lege den Schlitten oben drauf und drücke sanft nach unten, um den Deckel mit dem Schlitten zu versiegeln. Umdrehen und untersuchen.
      2. Alternativ kann man auf ähnliche Weise einen Algenzähl-Slide und einen Deckel-Streuer verwenden. Beachten Sie, dass Dias mit dieser Tiefe in der Regel nicht mit einer Objektivlinse von mehr als 20-facher Vergrößerung untersucht werden können.

Results

Abbildung 1: Schritte bei der Vorbereitung einer Probe zur Bestimmung der Anzahl gebundener Bakterien. Agrobacterium tumefaciens bindet an Tomatenwurzelhaare (A, B und C) und an Nylonfäden (D, E und F). In Proben, die ohne Waschen in...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lichtmikroskop	Jede	N/A	Phasenkontrast oder Nomarski-Optik sind hilfreich, für Studien mit fluoreszierenden Markern ist ein Fluoreszenzmikroskop erforderlich.
Saatgut	Jede	N/A	Notieren Sie sich die Samen-Chargennummer und die Sorte
Bleichmittel	Jede	N/A
Bath-Sonikator	Irgendein Firma für wissenschaftliche Bedarfsmaterialien	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Nährstoffagar	Difco	2001-01-08
Soytone	Difco	24360
Sand	Meeressand Fisher Scientific	S25
Sand	Sigma-Aldrich	S9887
Behälter	Stuewe & Sons, Inc.	Ray-Leach-Kegelhalter	Es gibt viele verschiedene Größen, die zur Art der Pflanze passen, die Sie anbauen möchten
Parafilm	Irgendein Firma für wissenschaftliche Bedarfsmaterialien	N/A
MS-Salze	Sigma-Aldrich	M5524
Sedgwick-Rafter-Zählzelle	Hauser Scientific	HS3800
Probe-Clip-Press-Siegel-Inkubatinkammer	Sigma-Aldrich	Z359483
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501