Stressgranulatbildung während der Shigella-Infektion von krebsartigen Epithelzellen

Zusammenfassung

Quelle: Vonaesch, P. et al., Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulatbildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die Infektion von Epithelzellen mit dem pathogenen Bakterium Shigella flexneri und die daraus resultierende zelluläre Reaktion des Wirts. Bakterielle Effektorproteine stören die Wirtstranslation und lösen die Bildung membranloser Organellen aus, sogenannte Stressgranulate, die die adaptive Reaktion der Zelle auf Infektionen widerspiegeln.

Protokoll

1. Herstellung von Bakterien und Wirtszellen

1. Übertragen Sie 12- oder 14-mm-Glasabdeckungen in entweder 24- bzw. 12-Loch-Platten mit steriler Pinzette, wobei pro Versuchsbedingung ein Bohrloch gezählt wird. Sterilisieren Sie diese durch ultraviolette (UV-)Behandlung in einer Gewebekulturhaube für 15 Minuten.
   HINWEIS: Kontrollbrunnen für bakterielle Herausforderungen und für die Induktion von Stressgranula (SG) durch exogene Stressfaktoren einzubeziehen.
2. Für eine 24-Well-Platte mit 12-mm-Deckfolien wird 1 x 10^{Säugetierzellen} (z. B. HeLa-Zellen) auf Deckfolien ausgesaat; Drücken Sie die Deckblätter mit einer sterilen Pipettenspitze nach unten. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in einem 5%-CO-2-Kulturinkubator in einem für jeden Zelltyp geeigneten Kulturmedium haften.
   HINWEIS: Plattenzellen, sodass der Zusammenfluss der Zellen am nächsten Tag zwischen 40 und 60 % liegt.
   1. Für HeLa-Zellen inkubieren Sie in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) und 10 % dekomplementiertem fetalem Kalbserum (FCS). Dekomplementieren Sie FCS, indem Sie das Serum 30 Minuten in einem 56 °C Wasserbad erhitzen und das Serum nach 15 Minuten einmal wirbeln.
3. Um Bakterien auszustreichen, verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um eine kleine Menge aus einem bakteriellen Glycerolfond (20 % Glycerol) in einem -80 °C Gefrierschrank zu entfernen und auf eine beschriftete Platte zu legen. Verwenden Sie eine sterile Schleife, um die Bakterien auf etwa 10 % der Platte zu verteilen. Benutze eine neue sterile Schlaufe und ziehe sie durch den Schmier, um drei parallele Linien zu bilden, die eine halbe Platte lang sind. Striche durch diese Linien und bedecke den Rest der Platte. Inkubiere die Platte O/N bei 37 °C.
   1. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie (z. B. Shigella flexneri) aus der frisch gestreiften Platte aus. Vermeiden Sie die Arbeit mit bakteriellen Kolonien, die älter als eine Woche sind.
   2. Für den S. flexneri-Stamm M90T sollte eine rote Kolonie aus einer frisch ausgestrichenen tryptischen Sojaagar-0,1% Kongo-Rotagarplatte in 8 ml tryptische Sojabrühe in einem 15-mL-Rohr geimpft werden; Den Deckel anziehen und beim Schütteln bei 222 U/min O/N bei 30 °C inkubieren. VORSICHT: Verwenden Sie keine großen weißen Kolonien, da sie das Virulenzplasmid verloren haben und nicht infektiös sind.

2. Bakterielle Herausforderung der Wirtszellen

1. Bereiten Sie Bakterien vor, um das Infektionspotenzial zu maximieren.
   1. Bei S. flexneri wird Bakterien subkultiviert, indem 150 μL O/N-Kultur zu 8 mL tryptischem Sojaagar hinzugefügt und bei 222 U/min bei 37 °C in der späten exponentiellen Phase (~2 Stunden) inkubiert wird, um die Expression des Virulenzgens zu induzieren und die Infektion zu verstärken.
      1. Wenn die Kultur eine optische Dichte zwischen 0,6 und 0,9 (gemessen bei 600 nm) hat, wird 1 ml Kultur in ein 1,5 mL Rohr übertragen. Pelletbakterien für 2 Minuten bei 8.000 x g und resuspendieren im Infektionsmedium (DMEM mit NEAA, ohne FCS) bei OD₆₀₀ = 1. Wenn also der OD₆₀₀ 0,85 beträgt, suspendieren Sie in 850 μL.
         HINWEIS: Bei S. flexneri gibt es bei OD₆₀₀ = 1 8 x¹⁰ 8 Bakterien pro ml, wenn sie in 8 mL Medium kultiviert werden. Eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 20 ist angemessen. Für andere Krankheitserreger müssen die Anzahl der Bakterien pro mL bei einem OD_{von 600} und das entsprechende MOI empirisch bestimmt werden.
   2. Um die Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Wirt zu verbessern, werden Bakterien mit Poly-L-Lysin (PLL) beschichtet.
      HINWEIS: Die PLL-Behandlung von S. flexneri hatte keinen Einfluss auf die SG-Dynamik. Andere Krankheitserreger müssen auf ihre Eignung für eine PLL-Behandlung untersucht werden.
      1. Um Bakterien mit PLL zu beschichten, zentrifugieren Sie 1 ml Bakterienkultur für 2 Minuten bei 8.000 x g und suspendieren Sie das Pellet dann in 10 μg/mL PLL in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei einem OD_{von 600} = 1.
      2. Gib die bakterielle Lösung zu einer kleinen Schale hinzu, zum Beispiel einem Brunnen innerhalb einer 12-Wellen-Platte, und inkubiere bei RT (~ 20 °C) für 10 Minuten mit sanftem Umrühren auf einem Tellerschütter.
      3. Pelletbakterien für 2 Minuten bei 8.000 x g entfernen, das überschüssige PLL entfernen. Suspendiere das Pellet in 1 mL PBS und wiederhole diesen Waschschritt zweimal. Nach dem letzten Waschen wird im Infektionsmedium bei OD₆₀₀ = 1 erneut suspendiert.
         HINWEIS: Hier ist das Infektionsmedium von S. flexneri ein Wirtszellmedium mit 20 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-Ethanesulfonsäure) (HEPES) ohne FCS.
2. Bereite die Zellen auf die bakterielle Herausforderung vor.
   1. Entfernen Sie das Medium aus HeLa-Zellen von Säugetieren mit einer Absaugpumpe. Fügen Sie 500 μL RT HeLa-Zellmedium hinzu, um die Zellen zu reinigen, zu schwenken, das Medium mit einer Saugpumpe zu entfernen und durch ein 500 μL Infektionsmedium bei Raumtemperatur (RT) zu ersetzen (z. B. Wirtszellmedium mit 20 mM HEPES ohne FCS).
   2. HINWEIS: Bei allen Waschschritten arbeiten Sie schnell und verarbeiten Sie nur bis zu 4 Deckschichten gleichzeitig, um das Austrocknen der Zellen zu vermeiden.
3. Challenge-präparierte HeLa-Zellen mit Bakterien, um 20 bis 50 % der Zellen zu infizieren.
   HINWEIS: Für jede Bakterienart müssen die geeignete Zeit und das Moi bestimmt werden. Im Allgemeinen ist ein guter Start 30 Minuten bei 37 °C mit einem MOI von 10.
   1. Für S. flexneri werden HeLa-Zellen mit einer der beiden Methoden herausgefordert (Schritt 2.3.1.1 oder 2.3.1.2).
      1. Nicht PLL-behandelte Bakterien (20 μL OD₆₀₀ = 1/Brunnen 24-Bohrloch-Platte in 500 μL Medium) für 10 Minuten bei 13.000 x g auf die Zellen schleudern.
      2. Fügen Sie PLL-beschichtete Bakterien hinzu (15 μL OD₆₀₀ = 1/Brunnen von 24 Bohrlochplatten in 500 μL Medium) für 15 Minuten an RT, damit sich Bakterien auf den Zellen ansiedeln können.
   2. Lassen Sie die Infektion stattfinden, indem Sie Zellen mit festgesetzten Bakterien für 30 Minuten in einen 37 °C Gewebekultur-Inkubator legen.
      HINWEIS: Für kurze Zeitpunkte synchronisieren Sie die S. flexneri-Infektion , indem Sie Platten für 15 Minuten in ein 37 °C Wasserbad legen, anstatt sie in den Gewebekultur-Inkubator zu legen.
4. Verhindern Sie die Infektion, indem Sie Zellen waschen.
   1. Um die Zellen zu reinigen und überschüssige Bakterien zu entfernen, entferne das Medium mit einer Saugpumpe, gib 1 ml frisches, vorgewärmtes (37 °C) HeLa-Kulturmedium (DMEM, 10 % FCS, NEAA) hinzu. Rühren Sie das Medium, entfernen Sie es und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Wiederhole das zweimal und lasse frisches Medium auf den Zellen.
      1. Bei S. flexneri oder anderen intrazellulären Bakterien wird nach der Infektion von HeLa-Zellen und den Washes das Medium durch ein Standard-Gewebekulturmedium mit 50 μg/mL Gentamicin ersetzt, um extrazelluläre Bakterien abzutöten und eine weitere Zellinvasion zu verhindern.
         HINWEIS: Fügen Sie dem Medium für extrazelluläre Bakterien keine Antibiotika hinzu.
5. Inkubieren Sie Bakterien mit Zellen für die gewünschte Zeit in einem Gewebekultur-Inkubator.
   HINWEIS: Bei S. flexneri kann die Infektion je nach Zelltyp bis zu 6 Stunden dauern. Bei HeLa-Zellen sollte die Infektion 1,5 bis 2 Stunden andauern, bevor exogene Belastungen hinzugefügt werden, um die Bildung von SG zu induzieren. Bei Caco-2-Infektionen, bei denen Shigella sich von Zelle zu Zelle ausbreitet, sollte man 30 Minuten bis 6 Stunden infizieren, bevor exogener Stress hinzugefügt wird. An diesem Punkt können Zellen fixiert werden, ohne exogene Belastungen hinzuzufügen, um die Bildung von SGs infolge der bakteriellen Infektion zu bewerten.

3. Fixations- und Immunfluoreszenzanalyse der Spannungsgranulatbildung

HINWEIS: Bearbeiten Sie die Kontroll- und experimentellen Überdeckfolien gleichzeitig, um Färbungsunterschiede zu vermeiden, die die Bildanalyse in späteren Schritten beeinträchtigen könnten. Die Kontrollproben enthalten keine Infektion mit und ohne SG-induzierende Behandlung sowie infizierte Proben mit und ohne SG-induzierende Behandlung.

1. Entfernen Sie das Medium vollständig mit einer Saugpumpe und fixieren Sie die Proben, indem Sie 0,5 ml RT 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS hinzufügen. Inkubiere 30 Minuten bei RT.
   VORSICHT: PFA ist schädlich für den Betreuer und die Umwelt. Ergreifen Sie geeignete Maßnahmen, um den Behandler zu schützen und chemische Abfälle zu entsorgen.
   HINWEIS: Alternativ fixieren Sie für 15 Minuten und ersetzen Sie dann durch -20 °C vorgekühltes Methanol für 10 Minuten, um eine stärkere zytoplasmatische Lokalisierung der SG-Marker zu erhalten.
2. Entfernen Sie das PFA mit einer Pipette und entsorgen Sie die Flüssigkeit in einem geeigneten Abfallbehälter. Waschen Sie den Deckmantel mit 1 ml tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3; 15 mM Natriumchlorid, NaCl). Inkubiere den Deckdeckel 2 Minuten lang mit sanftem Schütteln auf einem Tellerschüttler während des Waschens.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Shigella flexneri			Erhältlich in verschiedenen Laboren auf Anfrage
Trypton-Kasein-Soja (TCS) Brühe	BD Biosciences	211825	Standard-Wachstumsmedium für Shigella, Anwendung – Bakterienwachstum
TCS-Agar	BD Biosciences	236950	Standard-Wachstumsagar für Shigella, Anwendung – Bakterienwachstum
Kongorot	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Diskriminierungsinstrument für Shigella , das das Virulenzplasmid verloren hat, Anwendung – Bakterienwachstum
Poly-L-Lysin (PLL)	Sigma-Aldrich	P1274	Nützlich, um Bakterien zu beschichten, um Infektionen zu erhöhen, Anwendung – Infektion
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Selektive Tötung extrazellulärer, aber nicht zytosolischer Bakterien, Anwendung – Infektion
HEPES	Lebenstechnologien	15630-056	Der pH-Puffer ist nützlich, wenn Zellen bei RT inkubiert werden, Anwendung – Zellkultur
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Lebenstechnologien	31885	Standardkulturmedium für HeLa-Zellen, Anwendung – Zellkultur
Fetales Kalbserum (FCS)	Biowest	S1810-100	5%-Supplementierung für HeLa-Zellkulturmedium verwendet, Anwendung – Zellkultur
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)	Lebenstechnologien	11140	1:100-Verdünnung für HeLa-Zellkulturmedium, Anwendung – Zellkultur
Dimethylsulfoxidid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Reagenzverdünner, Anwendung – Zellkultur
Paraformaldehyd (PFA)	Elektronenmikroskopie-Szenen	15714	4 % PFA werden für die Standardfixierung von Zellen verwendet, Anwendung – Fixierung
24-Bohrloch-Zellkulturplatte	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standard-Gewebekulturplatten, Anwendung – Zellkultur
12-mm-Glasabdeckfolien	NeuVitro	1001/12	Zellkulturunterstützung für immunfluoreszente Anwendungen, Anwendung – Zellunterstützung
Pinzette	Sigma-Aldrich	81381	Günstiges und robustes Montagemedium, das für die meisten Fluorophore gut funktioniert, Anwendung – Montage