Fluoreszenzbildgebung der bakteriellen Besiedlung im Nierengewebe der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Behera, R. K. et al. Eine fluoreszenzbasierte Methode zur Untersuchung der bakteriellen Genregulation in infizierten Geweben. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Herstellung infizierter Mausnieren, zur DNA-Färbung und zur Erkennung bakterieller Genexpression mittels dualer fluoreszierender Reporter. Rot markiert alle Bakterien, und Grün hebt infektionsempfindliche Zellen hervor.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tierproben betreffen, wurden vom zuständigen ethischen Ausschuss für Tiere überprüft und genehmigt.

1. Organentnahme und Gewebeverarbeitung
   1. Die Tiere als sekundäre Methode durch CO2-Inhalation und zervikale Verrenkung einschläfern und eine Obduktion durchführen.
   2. Entnehmen Sie die Niere (rechts) und andere lebenswichtige Organe (Herz, Leber, Lunge, Milz) und übertragen Sie sie in 15-ml-Polypropylenröhren mit 10% [v/v] gepuffertem Formalin.
   3. Lassen Sie die Organe im Dunkeln bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln oder Rotation mindestens 24 Stunden, aber nicht länger als 48 Stunden fixieren.
   4. Organe in ein klares Gefriermedium einbetten und das Gewebe bei -80 °C aufbewahren.
   5. Mit einem Kryostat wird das Gewebe in Scheiben mit einer Dicke von 10 μm geschnitten.
   6. Trockne die Stücke auf einem vorgereinigten, aufgeladenen Glas-Dia 20 Minuten im Dunkeln. Tragen Sie ein hartes Montagemedium mit einer 4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)-Lackierung und einem Deckdeckel auf. Über Nacht werden montierte Objektträger bei Zimmertemperatur ausgehärtet und auf 4 °C für die Langzeitlagerung übertragen.
2. Laser-Rasterkonfokalmikroskopie und Bildverarbeitung
   1. Untersuchen Sie montierte Objektträger, um Läsionen mit Lasern zu identifizieren, die für den verwendeten Leuchtstoffreporter geeignet sind. In diesem Fall werden die grünen (GFP oder grünes fluoreszierendes Protein), rote (tdTomato) und blaue (DAPI) Fluoreszenzsignale verwendet.
   2. Erfassen Sie das Bild mit dem passenden Objektiv zur Visualisierung einzelner Zellen (z. B. werden typischerweise 20- oder 40-fache Objektive verwendet).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C57Bl/6 Mäuse	Charles River	NA
Konfokales Laserscanningmikroskop	Zeiss	NA
Kryostat-Mikrotom	Thermowissenschaftlich	NA
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Precellys 24 Homogenisator	Bertin Laboratories	NA
Sub Xero Clear Tissue Freezing Medium	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus Mikroskop-Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15
Vectashield Antifade-Montagemedium mit DAPI	Vektorlabore	H-1500