Bildgebung morphologischer Veränderungen bei Bakterien mittels lebender Zellfluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Brzozowski, R. S. et al. Live-Cell-Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der subzellulären Proteinlokalisierung und Veränderungen der Zellmorphologie bei Bakterien. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert die Fluoreszenzmikroskopie mit lebenden Zellen, um morphologische Veränderungen in Echtzeit bei Bakterien zu visualisieren. Es beschreibt die Schritte, die für Bildgebung, Zeitrafferaufnahme und Dekonvolution erforderlich sind, um hochauflösende Bilder in Echtzeit zu erhalten.

Protokoll

1. Bildverarbeitung

1. Am Tag des Experiments schalten Sie das Mikroskopsystem ein. Starten Sie die Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle), indem Sie auf das entsprechende Symbol auf dem Desktop klicken. Initialisieren Sie das Mikroskop, indem Sie im Startfenster der Software auf die Option "Mikroskop initialisieren " (mit einem Mikroskop gezeigten Button) klicken. Stellen Sie sicher, dass das Ziel vor der Initialisierung mit der groben Einstellung des Mikroskops vollständig abgesenkt wird.
   HINWEIS: Nach der Initialisierung sollten zusätzlich zum Startmenü drei zusätzliche Dialogfenster erscheinen: resolve3D, Datenerfassung und Filtermonitor.
2. Geben Sie einen Tropfen 1,517 (Brechungsindex) Öl auf das vom Hersteller bereitgestellte 100-fache Ölimmersionsobjektiv (numerische Apertur = 1,4, Arbeitsabstand = 0,12 mm; siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Es ist wichtig, das geeignete Immersionsöl für die Temperatur auszuwählen, bei der die Bildgebung durchgeführt wird.
3. Laden Sie die Glasbodenschüssel mit der Probe in das Metallgehäuse (Sarg) und schieben Sie sie vorsichtig in die Bühnenklemme.
4. Benutze den groben Einstellknopf, um das Objektiv anzuheben, bis das Öl den Glasboden der Schale berührt. Benutze das Okular und den Feinverstellknopf, um die Probe scharf zu stellen. Sobald die Zellen scharf sind, drehen Sie den Knopf vom Okular in den Kameramodus, indem Sie den Schalter an der Vorderseite des Mikroskopgehäuses nach links bewegen.
5. Beginnen Sie das Experiment mit der Bildgebungssoftware. Im resolve3D-Fenster wählen Sie das Design/Run-Experiment-Symbol , das von einer Flasche dargestellt wird. Ein neues Dialogfeld sollte mit dem Titel Design/Run Experiment erscheinen.
   1. Setze die Anzahl der Z-Stacks und die Probendicke mit dem Design-Tab und dann die Sektionierung im Design-/Ausführen-Experiment-Dialogfeld .
      HINWEIS: Für die Experimente im Bereich repräsentative Ergebnisse wurden 17 Z-Stacks im Intervall von 200 nm für Standbilder und vier Z-Stacks im 200-nm-Intervall für Zeitraffermikroskopie verwendet.
   2. Um die Dicke der Zellen in der Probe zu messen, passen Sie die Z-Ebene manuell schrittweise an, indem Sie die Pfeile nach oben und unten im Dialogfeld von resolve3D verwenden. Markieren Sie, wo die Zellen unscharf werden, als obere und untere Grenze für die Bildaufnahme. Importiere diese Informationen, bevor du das Experiment ausführst.
   3. Um Phototoxizität und Photobleaching während der Zeitrafferbildgebung zu minimieren, reduzieren Sie die Anzahl der Z-Stacks und wählen Sie die Mittelebene der Zellen für die Bildaufnahme.
6. Wählen Sie das passende Filterfeld für das Experiment mit dem Design- und dann Kanal-Tab im Design/Run-Experiment-Dialogfeld aus (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. Wählen Sie außerdem eine Referenz für die Sammlung von POL/DIC-Informationen aus. Passen Sie die prozentuale Transmission (Lichtintensität) und die Belichtungsdauer für einzelne vor der Bildaufnahme ausgewählte Kanäle an, indem Sie die entsprechenden Optionen im Dialogfeld resolve3D auswählen.
      HINWEIS: In einem Testfeld, das für das Experiment nicht berücksichtigt wird, werden diese Einstellungen getestet, um festzustellen, ob die ausgewählten Parameter sinnvolle Fluoreszenzdaten erhalten, ohne ein schwaches Signal zu übersehen oder zu übersättigen. Importiere dann diese Parameter für das experimentelle Setup.
7. Öffnen Sie die Punkteliste, indem Sie im Dialogfeld 'Punkte' auswählen. Ein neues Dialogfeld sollte mit dem Titel Punktliste erscheinen. Markieren Sie mehrere Sichtfelder, die im Experiment verwendet werden sollen, indem Sie geeignete Sichtfelder mit den Prüfelementen des Mikroskops finden und im Dialogfeld zur Punktliste die Punktmarkierungsoption auswählen.
   HINWEIS: Jedes Mal, wenn das Mikroskop auf einen Punkt in der Punktliste neu fokussiert wird, muss ein Ersatzpunkt ausgewählt werden. Dies kann erreicht werden, indem man das Mikroskop auf den entsprechenden Punkt in der Liste fokussiert und dann den Austausch-Punkt auswählt. Es ist wichtig, beim Neufokussieren nicht den analogen Grobe-/Feineinstellknopf zu berühren; Benutze nur die Software, um den Fokus anzupassen.
8. Stellen Sie Zeitrafferparameter ein, indem Sie zuerst den Design- und dann den Zeitraffer-Tab im Design-/Ausführen-Experiment-Dialogfeld auswählen. Wählen Sie das Kästchen für Zeitraffer aus. Geben Sie die entsprechenden Zeitrafferparameter in Bezug auf Zeitrafferbilder/Gesamtzeit ein.
9. Setze Punkte, die aus der Punktliste abgebildet werden sollen, indem du zuerst den Design - und dann den Punkte-Tab im Design/Ausführen-Experiment-Dialogfeld auswählst. Wählen Sie die Option für die Liste der Besuchspunkte und geben Sie Punkte ein, die abgebildet werden sollen, im Textfeld, getrennt durch Kommas oder Bindestriche, falls es sich um eine vollständige Sequenz handelt.
10. Bevor Sie ein Experiment beginnen, bearbeiten Sie Dateinamen und Dateistandorte mit dem Reiter Ausführen im Design/Ausführen-Dialogfeld. Der Dateistandort kann geändert werden, indem man den Einstellungsknopf auswählt, den Datenordner auswählt und dann den entsprechenden Ordner auswählt oder einen neuen erstellt. Ändern Sie Dateinamen, indem Sie den neuen Dateinamen in das Textfeld des Bilddateibestands eingeben.
11. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie im Dialogfeld "Experiment beginnen" auf die Play-Schaltfläche klicken.
    HINWEIS: Für Zeitraffer sollten Sie während des gesamten Experiments den Fokus in jedem Sichtfeld kontinuierlich mit der DIC-Einstellung überprüfen (um unnötiges Photobleaching zu vermeiden) und die Informationen in der Punktliste neu fokussieren und aktualisieren, da die Zellen mit der Zeit oft unscharf werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	Fisher-BioReagenzien	BP160-100	Molekularbiologie-Note – Niedriger EEO
FM4-64	Invitrogen	T3166	Mikroskopie
Schüssel mit Glasboden	MatTek	P35G-1.5-14-C	Mikroskopie
Mikroskop	GE	DeltaVision Elite	Angepasster Olympus IX-71 Spiegel mit umgekehrtem Mikroskop; Maßgeschneiderter Beleuchtungsturm und Transmit-Light-Illuminator-Modul. Ziele: PLAPON 60X (N.A. 1,42, WD 0,15 mm); OLY 100X ÖL (N.A. 1,4, WD 0,12 mm); DIC Prism Nomarski für 100-faches Ziel; CoolSnap HQ2 Kamera; SSI Assembly 7-Color; Umweltschutzkammer – undurchsichtig.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	FtsZ-Inhibitor
SoftWorx	GE		Hersteller bereitgestellte Bildgebungssoftware