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Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.
1. Inokulation von Listeria monocytogenes in Mäuse mittels Schwanzveneninjektion und Bewertung der bakteriellen Belastung in Leber, Milz und Herz
HINWEIS: Alle Tierarbeiten werden gemäß den CDC-Biosicherheitsrichtlinien der Stufe 2 durchgeführt. Mäuse werden typischerweise eine Woche im Voraus bestellt und zusammen mit 5 Tieren pro Käfig eingesperrt. Mäuse dürfen sich vier Tage lang an die neue Laborumgebung gewöhnen, bevor sie gespritzt werden. Diese Experimente verwendeten 6 bis 8 Wochen alte weibliche Swiss-Webster-Mäuse, die fünf Personen in einem Käfig in einer Barriereumgebung gehalten und mit einer nicht eingeschränkten Ernährung gefüttert wurden.
- Bereiten Sie jeweils einen Käfig mit Mäusen vor, indem Sie den Deckel und die Futter-/Wasserbehälter entfernen und den Käfig für fünf Minuten unter eine Wärmelampe stellen. Dieser Prozess ermöglicht es, dass sich die Schwanzvenen erweitern, was die Durchführung von Injektionen erleichtert.
- Nehmen Sie ein Tier heraus und legen Sie es in ein Geschirr (oder ein Falkenrohr mit abgeschnittenem Ende), um das Tier während der Injektion festzuhalten.
- Reinigen Sie die Injektionsstelle mit einem Alkoholpad und lassen Sie den Alkohol verdunsten. Dies reinigt nicht nur die Stelle, sondern erweitert auch die Schwanzvene weiter.
- Mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27,5-Gauge-Nadel wird die Maus vorsichtig mit 200 μl der gewünschten Kultur in die Schwanzvene injiziert.
- Verwenden Sie eine Mullbinde, um eventuelle Blutungen durch die Injektion zu stoppen, und legen Sie das Tier in einen frischen Käfig.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Tiere und Stämme. Achte darauf, jeden Käfig mit Tieren mit dem erhaltenen Stamm zu beschriften.
- Kontrollieren Sie die Tiere täglich, entfernen und opfern Sie alle Tiere, die krank erscheinen. Wenn keine Tiere Anzeichen von Krankheit zeigen, lassen Sie die Infektionen 72 Stunden andauern, bevor alle Tiere geopfert werden.
- Zum Opfer verwenden Sie CO-2-Anästhesie aus einer abgefüllten Quelle, bis alle Atmungen aufgehört haben, und verwenden Sie dann eine zervikale Verrenkung, um sicherzustellen, dass das Tier tot ist.
- Nach dem Opfer werden die Tiere in eine Gewebekulturhaube zur Dissektion gebracht.
- Mit einem Sektionsblock stecken Sie jedes Bein des Tieres mit großen Nadeln an und sprühen Sie es mit 70 % Ethanol ein, bis es gesättigt ist.
- Schneiden Sie die Haut des Bauches und des Thorax mit einem Y-förmigen Schnitt ab, der sich von der Vaginalöffnung bis zum Xiphoideusfortsatz erstreckt und dann bis zur Achselhöhle jedes Arms fortschreitet.
- Ziehe die Haut zurück und entferne die Nadeln von jedem Bein, um die Dissektion offen zu halten.
- Schneiden Sie sanft durch das Peritoneum und legen Darm, Magen, Leber und Milz frei.
- Indem Sie zuerst die Lebervene und das koronale Band oben in der Leber durchtrennen, beginnen Sie mit der Entfernung der Leber. Zusätzliche Bänder, die entfernt werden müssen, befinden sich unter der Leber, die sie mit dem ersten Abschnitt des Dünndarms sowie mit der Muskulatur des Rückens verbinden.
- Lege die Leber in 5 ml steriles ddH20 in eine 50 ml Falkenröhre.
- Anschließend werden die Milz isoliert und vorsichtig die Gefäße und Bänder entfernt. Die Milz lässt sich leichter entfernen als die Leber. Lege die Milz in ein separates Falkenrohr mit 5 ml sterilem ddH20.
- Lokalisieren Sie das Zwerchfell und schneiden Sie sanft entlang des Brustkorbs, um den Thorax sichtbar zu machen. Schneide durch den Xiphoideusfortsatz und das Brustbein bis auf Halshöhe, um den Thorax zu öffnen und Herz und Lunge freizulegen.
- Mit einer Pinzette greifen Sie das Herz vorsichtig an seiner Spitze und heben es so an, dass Aorta und Lungengefäße in Spannung stehen. Schneide diese Gefäße, um das Herz zu befreien.
- Setzen Sie das Herz in eine 50-ml-Falkenröhre mit 5 ml sterilem ddH20.
- Entsorgen Sie den Mäusekadaver und wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Tier, wobei saubere Falkenröhrchen verwendet werden, die für jedes entfernte Organ 5 ml sterile ddH20 enthalten.
- Nachdem alle Organe entfernt wurden, reinigen Sie die Arbeitsstation und kehren Sie zur Bank zurück.
- Bereiten Sie ein Set von 5 Röhren vor, die zur Reinigung und Sterilisation des Homogenisators für jedes Organset von fünf Mäusen verwendet werden sollen (d. h. ein 5-Röhrchen-Set für 5 Leber, 5 Röhren für 5 Milzen und 5 Röhren für 5 Herzen). Vier von jedem der Röhrchen sollten mit 30 ml sterilem ddH20 gefüllt werden, und eines sollte mit 30 ml 90% EtOH gefüllt werden.
- Mit einem TissueMaster (oder einem gleichwertigen Homogenisator) tauchen Sie den Homogenisator (während des Laufens) in die in Schritt 1.21 vorbereiteten Röhren wie folgt zur Reinigung der Sonde:
- Röhre 1 (ddH2O) 5 Sek in Röhre 2 (ddH2O) 5 Sek in Röhre 3 (EtOH) 5 Sek in Röhre 4 (ddH2O) 5 Sek in Röhre 5 (ddH2O)
- Homogenisieren Sie eine Leber mit dem Homogenisator für mindestens 2 Minuten oder bis keine sichtbaren Organteile mehr übrig sind. Verwenden Sie eine Pinzette, um große Schmutz von der Sonde zu entfernen.
- Wiederholen Sie den beschriebenen Reinigungsvorgang.
- Wiederholen Sie den Homogenisierungsprozess für die anderen Lebern und reinigen Sie die Sonde zwischen den Lebern mit dem beschriebenen Prozess.
- Nachdem alle Lebern vollständig homogenisiert sind, entsorge die Waschrohre (1-5) für die Leber.
- Wiederhole den Homogenisierungs-/Reinigungsprozess sowohl für die Milz als auch für das Herz und achte darauf, für jede Organserie einen neuen Waschschlauch zu verwenden. Sollten die Waschschläuche irgendwann trüb werden, entsorgen Sie sie und ersetzen Sie sie durch neue, um die Serie abzuschließen.
- Nachdem alle Organe homogenisiert wurden, führen Sie einen letzten Reinigungszyklus am Homogenisator durch und trocknen Sie ihn gründlich zur Lagerung.
- Geben Sie etwa 200 μl jedes Organs in einen einzelnen Schacht einer 96-Well-Platte.
- Führen Sie serielle Verdünnungen an den Organproben durch, indem Sie 1:10 in einer Serie bis zu einer 1:10.000-Verdünnung (Leber und Milz) oder bis zu einer 1:1.000-Verdünnung (Herz) durchführen.
- Punktverdünnen Sie die Verdünnungsserie auf vorgewärmten LB-Agar. Entfernen Sie außerdem 20 μl von jedem unverdünnten Organ und Platte auf separate LB-Agarplatten, um die CFU aus schlecht kolonisierten Organen aufzuzählen.
- Entsorgen Sie die Falkenröhren mit den homogenisierten Organen und wickeln Sie die 96-Well-Platten mit der Verdünnungsserie mit Parafilm und legen Sie sie bei -80 °C in eine Gefrierbox.
- Lass die Stellen trocknen. Dieser Vorgang wird beschleunigt, indem die Platten in die Haube gelegt und die Deckel entfernt werden.
- Nachdem die Flecken getrocknet sind, stellen Sie die Platten über Nacht in einen 37 °C Inkubator.
- Zählen Sie am nächsten Morgen die Anzahl der Kolonien an jedem Ort und verwenden Sie die Verdünnungsserie, um die Gesamtzahl der Bakterien pro Organ zu berechnen.