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Alle Verfahren, die Tierproben betreffen, wurden vom zuständigen ethischen Ausschuss für Tiere überprüft und genehmigt.
1. Infektion
- Besorge BALB/c-Mäuse beider Geschlechter im Alter von 10 bis 12 Wochen.
HINWEIS: Streptococcus pneumoniae serotyp-4-Stamm TIGR4 ist ein virulenter klinischer Isolat, der sequenziert wurde. - TIGR4 wird in Todd-Hewitt-Brühe bei 37 °C in 5 % CO2 angebaut, bis eine optische Dichte (OD)620 von 0,5 erreicht wird (entsprechend 1,0 x 108 koloniebildenden Einheiten [CFU]/ml). Die Pneumokokkenkultur durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 3.500 x g pelletieren und das Überlagerungsmittel mit einer Vakuumleitung entfernen. Suspendieren und verdünnen Sie Bakterien mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 1,0 x 104 CFU /ml.
- Mit einer Induktionskammer betäuben Mäuse mit 2,5 % verdampftem Isofluran in Sauerstoff. Bestätigen Sie den betäubten Zustand durch sanftes Zehenkneifen mit einer stumpfen Pinzette.
- Mit einer Hand hält man die narkosierte Maus am Nacken und aufrecht und injiziert jede Maus intraperitoneal (i.p.) mit 100 μl der S. pneumoniae-Suspension mit einer Spritze und einer 27-30-Gauge-Nadel (entsprechend einer Challenge-Dosis von 1,0 x 103 CFU). Setze die Maus zurück in ihren Käfig. Mäuse wachen typischerweise 30-40 Sekunden nach der Injektion auf.
- Lassen Sie die Infektion mindestens 24 (früh) oder 30 (fortgeschritten) Stunden andauern.
- Euthanasiere die Mäuse durchCO2-Erstickung . Führen Sie eine zervikale Verrenkung durch, um sicherzustellen, dass die Maus abgestorben ist. Die Euthanasie wird durch die Entfernung des Herzens in Schritt 1.6 weiter bestätigt.
- Desinfizieren Sie den Schwanz mit einem Alkoholabstrich und schneiden Sie einen 2–3 mm langen Abschnitt ab. Sammeln Sie 2 μl Blut und verdünnen Sie das Blut serienweise 10-fach in PBS mit Natriumheparin 1 U/ml fünfmal. Plattenserielle Verdünnung auf einer tryptischen Soja-Blutagarplatte und Inkubation über Nacht bei 37 °C in 5 %CO2. Am nächsten Tag zählt man aus der Kolonie den Grad der Bakteriämie.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage auf einer chirurgischen Plattform fest. Besprühe die Brust mit 70 % Ethanol und tupfe sie trocken. Mit chirurgischer Schere und Pinzette öffnen Sie die Brusthöhle, entfernen Sie den Brustkorb und durchschneiden Sie das Zwerchfell, um Herz und Lunge freizulegen. Mit einer Schere schneiden Sie die mit dem Herzen verbundenen Blutgefäße durch und schneiden Sie das Herz vorsichtig heraus, um mit der Pinzette keine Blutergüsse zu bekommen.
- Spülen Sie das Herz mit PBS und legen Sie es dann in Gewebeprobensammlungskassetten, sodass beim Gewebeschnitt Koronalschnitte entsteht. Für die Paraffin-Einbettung werden die Kassetten in eine 10%-gepufferte Formalinlösung gelegt und am nächsten Tag die Paraffin-Einbettung eingebettet.
- Alternativ wird mit optimaler Schneidetemperatur (O.C.T.)-Mischung in einem Kryomold, der auf Trockeneis gelegt wurde, gefroren.
2. Visualisierung von Herzläsionen und Pneumokokken innerhalb von Läsionen
- Schneiden Sie paraffinhaltige Herzabschnitte so, dass in jedem Gewebeschnitt die vier Herzkammern sichtbar sind. Schneiden Sie die Objektträger mit einer Dicke von 5 μm.
- Deparaffinisieren und färben Sie Objektträger mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) mit Standardmethoden.
- Betrachten Sie H&E-gefärbte Herzschnitte mit einem Lichtmikroskop bei niedrigen (100X, 200X) und hohen (Ölimmersion: 400X, 1.000X) Vergrößerungen. Charakterisieren Sie Herzen hinsichtlich des Vorhandenseins von Mikroläsionen im Myokard. Hier werden H&E-Bilder mit einem Zeiss Axioskop 2 Mikroskop mit einem 100X 1,3 numerischen Blendenobjektiv von Plan-NEOFLUAR aufgenommen.
HINWEIS: In frühen Stadien unterscheiden sich Herzläsionen durch ihr unterschiedlich gefärbtes Aussehen und in einigen Fällen durch das Vorhandensein von Immuncellen (Monozyten und Granulozyten), die wie Monozyten erscheinen. Bei fortgeschrittenen Läsionen, insbesondere bei solchen nach 30 Stunden, fehlen Immunzellen, und an ihrer Stelle werden große, vakuolenähnliche Läsionen beobachtet. Es ist wichtig zu beachten, dass ein Influx von Immunzellen in den frühen Stadien der Herzläsionentwicklung auftreten kann, dies jedoch offenbar keine Voraussetzung ist.