PCR-basierte Detektion lebensmittelbedingter Krankheitserreger aus angereicherten Fliegenproben

Zusammenfassung

Quelle: Pava-Ripoll et al. Nachweis von lebensmittelbedingten bakteriellen Krankheitserregern aus einzelnen Schmutzfliegen. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video demonstriert eine PCR-basierte Methode, die gezielte bakterielle DNA aus angereicherten Fliegenproben mit pathogenspezifischen Tabletten ampliziert und so eine Echtzeit-Fluoreszenzerkennung und Schmelzkurvenanalyse ermöglicht, um das Vorhandensein lebensmittelbedingter Krankheitserreger bei einzelnen Insekten zu bestätigen.

Protokoll

1. Hydrat-PCR (Polymerase-Kettenreaktion) – Fertige Tabletten

1. Wählen Sie einen gekühlten (4 °C) PCR-Kühlblock und setzen Sie ein PCR-Röhrenrack über den Einsatz.
2. Platzieren Sie entsprechende PCR-Tuben mit den PCR-fertigen Tabletten (bei jedem Kit) für den Ziel-Lebensmittelkrankheitserreger in den Halter, laut der Rack-Datei.
3. Mit dem Entdeckungswerkzeug entfernen Sie vorsichtig die Kappen von PCR-Tuben. Entferne die Kappen und überprüfe, ob jede Tube eine Tablette enthält.
4. Übertragen Sie 50 μl (für Salmonellen und Cronobacter) oder 30 μl (für L. monocytogenes) Lysat auf spezifische PCR-Röhrchen. Verwenden Sie neue optische Kondensatoren und befestigen Sie sie mit dem Verschlusswerkzeug fest an den PCR-Röhren.
   HINWEIS: Nach dem Zufügen des Lysats zu PCR-tauglichen Tabletten müssen die Proben bei 2 bis 8 °C gekühlt bleiben, bis sie in das PCR-basierte Detektionssystem geladen werden. Die PCR-Röhren können bei 2.500 x g für einige Sekunden zentrifugiert werden, um sicherzustellen, dass das volle Volumen am Boden des Rohrs liegt.
5. Laden Sie die PCR-Röhren in das PCR-Zyklus-/Detektionssysteminstrument, indem Sie die Instrumentenschublade öffnen.
6. Setze das Rack mit PCR-Röhrchen in die Schachträume in der Schublade und prüfe, ob die Schläuche richtig sitzen.
7. Schließen Sie die Schublade und starten Sie das Programm gemäß dem Protokoll des Herstellers.
   HINWEIS: Das PCR-basierte Instrument hat für jeden lebensmittelbedingten Erreger voreingestellte Zyklusparameter.
8. Überprüfen Sie, dass die PCR-Cycling-Statusleiste einen blauen Balken anzeigt, der anzeigt, dass der Verstärkungsteil des Programms läuft.
   HINWEIS: Bei Standard-PCR-Tests dauert die Bearbeitungszeit des gesamten Programms (Verstärkung und Nachweis) etwa 3 bis 3,5 Stunden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kappwerkzeug	DuPont	D11677028
Entdeckungswerkzeug	DuPont	D11134095
PCR-Röhrenhalter/Halter	DuPont	D12701663
Feine Spitze, gerade Spitzen-Zange	BioQuip	4731	Vor der Anwendung sterilisieren. Mehrere Lieferanten.
Kühlblock			Mehrere Lieferanten.
Zentrifuge			Mehrere Lieferanten.