Ein schneller, bildbasierter Test zur Überprüfung oberflächeninduzierter bakterieller Virulenz

Zusammenfassung

Quelle: Perinbam, K., und Siryaporn, A. Ein schneller, bildbasierter bakterieller Virulenztest mit Amöben. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert eine schnelle, bildbasierte Methode zur Beurteilung der bakteriellen Virulenz, indem Amöben mit oberflächengebundenen oder planktonischen Bakterien inkubiert, ein Calcein-Acetoxymethylester (Calcein-AM) Agarose-Pad angewendet und Fluoreszenz bildgeblich zur Erkennung von Wirtszellschäden durchgeführt wird.

Protokoll

1. Mikroskopie – Vorbereitung des Agar-Pads

1. Bereiten Sie Agar-Pads etwa 30 Minuten bis 1 Stunde vor, bevor die Amöben bereit sind, mit Pseudomonas aeruginosa gemischt zu werden.
2. Mikrowelle 50 mL 1 % (w/v) Agar im Entwicklungspuffer (DB) in einer 250-mL-Kolben. Alle 20 Sekunden mischen, bis Agar-Klumpen verschwunden sind.
3. Kühlen Sie den geschmolzenen Agar ab, indem Sie ihn für 15 Minuten in ein vorgeheiztes 55 °C Wasserbad geben.
4. Fügen Sie 15 μL der Calcein-AM-Serienlösung zu 15 ml des geschmolzenen Agars in einem konischen Rohr hinzu. Mischen Sie, indem Sie das Rohr 4 bis 5 Mal sanft umdrehen, und gehen Sie sofort zum nächsten Schritt über.
   HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in einem 15-mL-Zentrifugenrohr aus Polypropylen durch. Verwenden Sie keinen dicken Glasbehälter, da dies dazu führt, dass der Agar zu schnell erstarrt.
5. Gießen Sie die geschmolzene Agarmischung auf eine Glasplatte von 12 cm x 10 cm und lassen Sie den Agar bei Zimmertemperatur 10 Minuten lang fest werden. Schneiden Sie das verfestigte Agar-Pad in kleinere Abschnitte von 1,5 cm x 1,5 cm, indem Sie die Glasplatte über ein gedrucktes Gitter legen und mit einem Metalllineal entlang des Gitters schneiden.
6. Bewahren Sie das Gel in einer feuchten Box auf, bis es einsatzbereit ist.

2. Mikroskopie – Vorbereitung der Bakterien-Amöbenprobe für die Bildgebung

1. Um die Virulenz oberflächengebundener bakterieller Zellen zu untersuchen, fügen Sie 10 μL Amöbenzellen an oberflächengebundene Bakterien hinzu.
   HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Vermischung von Amöben mit Bakterien.
2. Um die Virulenz planktonischer Zellen zu untersuchen, mischen Sie 10 μL Amöbenzellen mit 10 μL planktonischen Bakterien.
   HINWEIS: Waschen Sie die axenal gezüchteten Amöbenzellen (bei einem OD₆₀₀ von 0,2 bis 0,5) nicht vor der Vermischung mit den Bakterien. In der Amöbenkultur wird aufgrund der Verwendung der antibiotisch-mykotisch-antimykotischen Lösung kein Wachstum von E. coli beobachtet.
3. Setzen Sie sofort das 1,5 cm x 1,5 cm große Calcein-AM-Agarpad aus Schritt 1.5 auf die Bakterien-Amöben-Mischung auf die Petrischale.
   HINWEIS: Legen Sie das Agarpad mit einer schnellen, sanften Bewegung auf die Mischung. Senken Sie das Pad nicht langsam auf die Mischung, da diese Bewegung dazu neigt, die Zellen zum Rand und von der Unterseite des Pads wegzudrücken. Dieser Schritt stellt sicher, dass Bakterien und Amöben gleichmäßig gemischt, immobilisiert und beide Zelltypen auf dieselbe Ebene beschränkt sind.
4. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie vorsichtig die restliche Flüssigkeit rund um das Agar-Pad auspipetten. Lass die Petrischale 20 Minuten bei Zimmertemperatur trocknen.
5. Decken Sie die Petrischale mit einem Deckel ab und brüten Sie die immobilisierte Amöben-Bakterien-Mischung bei Zimmertemperatur weitere 40 Minuten aus. Fahren Sie zu Schritt 3.1 fort.
   HINWEIS: Es ist wichtig, alle Proben für gleich lange Zeit zu inkubieren, da die Hintergrundfluoreszenz im Laufe der Zeit zunimmt. Eine Brutzeit von 1 Stunde wird empfohlen. Inkubationen von mehr als einer Stunde sind weniger reproduzierbar, da Amöbenzellen zu platzen beginnen können.

3. Mikroskopie – Bildaufnahme

1. Bilde Amöben mit einem Fluoreszenzmikroskop, das in der Lage ist, Hellfeld- und Grünfluoreszenzbilder zu erfassen. Für grüne Fluoreszenz verwenden Sie grüne Fluoreszenzproteinfilter (GFP) mit 474/27 nm bzw. 525/45 nm für Anregung und Emission. Verwenden Sie ein 10X (≥0,3 numerische Blende) Objektiv, um die Amöben zu fotografieren.
   HINWEIS: Das Calcein-AM im Agar bewirkt, dass sterbende Amöben im grünen Fluoreszenzkanal fluoreszieren. Gesunde Amöben sind ansonsten nicht fluoreszierend.
2. Anpassung der Aufnahmezeiten für den Phasenkontrast und GFP-Kanäle, um die Phototoxizität zu begrenzen und den Dynamikbereich der Bildintensitäten zu optimieren. Ersetzen Sie bei Bedarf den Phasenkontrast des differentiellen Interferenzkontrasts (DIC).
   HINWEIS: Verwenden Sie 100 bis 200 ms Belichtungen für Phasenkontrast und GFP-Fluoreszenz, wenn möglich. Lassen Sie die Belichtungs- und Instrumenteneinstellungen während des gesamten Experiments unverändert. Dies ist entscheidend für die Berechnung des Host-Killing-Index.
3. Erwache Bilder von mindestens 100 Amöbenzellen, um gute Statistiken zur Berechnung des Wirt-Kill-Index zu erhalten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
Bacto-Agar, dehydriert	BD Difco	214010
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)	Lebenstechnologien	15240062	Aliquot < 1 mL und bei -20 °C aufbewahren
Calcein-Acetoxymethylester (Calcein-AM)	Lebenstechnologien	C34852	Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calciumchlorid, wasserfrei	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glukose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	D5879
Folsäure	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266
Hefeextrakt	Oxoid	LP0021
Spezieller Pepton	Oxoid	LP0072
Kaliumhydroxid	Fisher Chemical	P250
Kaliumphosphat-Monobas	Sigma-Aldrich	P0662
Natriumphosphat-Dibasisch Heptahydrat	Fisher Chemical	S373
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Stämme
Dictyostelium discoideum	Siryaporn-Labor	Stämm AX318
Escherichia coli	Siryaporn-Labor	Stämm B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn-Labor	PA14	PA14-Stamm 19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn-Labor	AFS20.1	PA14-abgeleiteter Stamm20
Vorräte
0,22 μm-Filter	Millipore	SCGPT01RE	Für Filtersterilisation
Konische Röhre, 15 mL	Corning	352097
Glasaufbewahrungsflaschen	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petrischale, 6 cm Durchmesser	Corning	351007	60 x 15 mm Polystyrolplatten
Petrischale, 10 cm Durchmesser	Fisher	FB0875712	100 x 15 mm Polystyrolplatten
Kunststoffbehälter mit Deckel	Ziploc	2,57E+09	Quadratische 3-Tassen-Behälter
Glasplatten	Bio-Rad	1653308	Zur Herstellung von Agar-Pads. Andere Glasplatten können mit ähnlichen Abmessungen verwendet werden.
Holzstöcke	Fisher	23-400-102
Ausrüstung
Eclipse Ti-E-Mikroskop	Nikon	MEA53100	Mikroskop-Aufbau
10X Plan Fluor pH1-Ziel 0,3 NA	Nikon	MRH20101	Mikroskop-Aufbau
Fluoreszenz-Anregungsquelle	Lumencor	Sola-Leichttriebwerk	Mikroskop-Aufbau
Fluoreszenzfilter-Set	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Mikroskop-Aufbau
Orca Flash 4.0 V2 Kamera	Hamamatsu	77054098	Mikroskop-Aufbau
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software zur Bildanalyse
MATLAB	Mathematikwerke	R2013	Software zur Bildanalyse
Orbitalshaker-Inkubator	VWR	89032-092	Für das Wachstum von Bakterien bei 37 °C
Plattformschüttler	Fisher	13-687-700	Für das Wachstum von Amöben bei 22 °C
Spektrophotometer	Biochrom	Ultrospec 10
Kühler Inkubator unter der Arbeitsfläche	Fisher	97990E	Für das Wachstum von Amöben bei 22 °C
Isotemp-Wasserbad	Fisher	15-462-21Q	Für die Kühlung von Medien bis 55 °C