Bewertung der bakteriellen Belastung in der Mausmilz für Infektionsstudien

Zusammenfassung

Quelle: Madenspacher, J. H. und Fessler, M. B. Eine nicht-invasive und technisch unintensive Methode zur Induktion und Phänotypisierung experimenteller bakterieller Pneumonie bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert den Prozess zur Quantifizierung der Bakterienlast in der Milz einer infizierten Maus, um die Schwere der Infektion zu beurteilen. Die homogenisierte Milz wird seriell verdünnt und plattiert, um die gesamte bakterielle Belastung zu bestimmen. Die daraus resultierenden Daten liefern Einblicke in die Wirts-Pathogen-Interaktionen im systemischen Gewebe.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.

1. Murine intratracheale Aspiration von Klebsiella pneumoniae aus dem Oropharynx

1. Stellen Sie sicher, dass Mäuse eindeutig durch Schwanzspur, Tattoo oder eine andere zugelassene Kennung identifiziert werden.
2. Ziehen Sie vor der Entfernung von Mäusen aus dem Isoflurane ein Dosierungsinokulum mit einer P200-Pipette auf, um den Eingriff zu beschleunigen. Für beste Ergebnisse mit I.T.-Aspiration verwenden Sie ein Volumen von <100 μl, um Überlauf zu verhindern. Hierin verwenden Sie 2000 koloniebildende Einheiten (CFU)/50 μl K. pneumoniae.
3. Betäuben Sie Mäuse in einer durchsichtigen Kammer mit Isoflurangas (z. B. 2 % Isofluran bei einer Durchflussrate von 1 L/min) oder gemäß institutionellen Richtlinien. Die Anzahl der Mäuse, die gemeinsam betäubt werden, wird durch das Wohlbefinden des Experimentators bestimmt, typischerweise jeweils 1–2. Beobachten Sie die Atmung und bestätigen Sie den Anästhesiegrad, sobald tiefe Atemzüge sichtbar sind und 2–3 Sekunden zwischen den Atemzügen gezählt werden können. HINWEIS: Wenn Bedenken hinsichtlich möglicher Störwirkungen flüchtiger (inhalierter) Anästhetika bestehen, kann stattdessen eine Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin erreicht werden. Mit der oben beschriebenen Methode hält die Tiefenanästhesie nur wenige Minuten an. Wenn eine längere Anästhesie eingeleitet wird, sollte eine Augensalbe verwendet werden, um das Austrocknen der Augen zu verhindern.
4. Sobald die Maus betäubt ist, positionieren Sie sie in einer halb liegenden Rückenlage, aufgehängt von den Kieferzähnzähnen an einem Gummiband, das zwischen den Stiften auf einer schiefen Plexiglasplatte gespannt ist (Abbildung 1).
5. Ziehen Sie die Mauszunge vorsichtig mit einer stumpfen, nicht gerippten Zange zur Seite und geben Sie die Dosis mit einer P200-Pipette in die Mundhöhle ein. Achten Sie besonders darauf, Traumata an der Zunge oder am Oropharynx zu vermeiden.
6. Während die Zunge zurückgezogen bleibt, verdecke die Nase vorsichtig mit einem behandschuhten Finger, bis die Maus einatmet. Bedecken Sie weiterhin die Nase, bis die Maus zwei oder mehr Einatmen genommen hat und keine Flüssigkeit mehr in der Mundhöhle sichtbar ist. Das Bedecken der Nase sorgt dafür, dass die Maus die Bakterien in die Lunge einatmet, da Mäuse zwanghaft Nasenatmer sind.
7. Nimm die Maus vom Impfboden und kehre zurück in ihren Käfig, wobei sie auf den Rücken gelegt wird, um zu verhindern, dass sich Bettwäsche oder Schmutz während der Narkose verstopft.
8. Sobald alle Mäuse behandelt wurden und aus der Narkose erwacht sind, werden Hausmäuse in einer Kabine/Raum in der nur Mäuse stehen, die mit K. pneumoniae behandelt wurden. Überwachen Sie täglich Mäuse, einschließlich Körpergewicht, wenn sie über 48 Stunden nach der Infektion hinausgehen.
9. Verwenden Sie tägliche Maische und/oder zusätzliche Hitze, wenn die Mäuse über 48 Stunden hinausgehen.

2. Bestimmung der Bakterienlast in Lungen- und peripheren Geweben

1. Vor Beginn: Bereite Verdünnungsröhrchen mit 900 μl 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für Lunge und Milz sowie 90 μl 1x PBS für Blut vor. Beschrifte Platten zur Bakterienkultivierung und stelle sie auf Raumtemperatur; Daher wird nach der Sammlung des Gewebes die Zeit zwischen Homogenisierung und Beschichtung für das Bakterienwachstum minimiert.
   HINWEIS: Aufgrund der heterogenen Ablagerung von Bakterien in der Lunge, die bei Aspiration auftreten kann, wird empfohlen, einzelne Mäuse zur Analyse entweder der gesamten Atemwegszellularität oder der gesamten (bilateralen) Lungenbakterienbelastung zu verwenden.
2. Euthanasiere Mäuse gemäß den institutionellen Richtlinien. Hier wird eine tödliche Injektion von 150 mg/kg Natriumpentobarbital oder eine entsprechende Dosis kommerzieller Euthanasielösung verwendet, gefolgt von Exsanguination, da dies mögliche Komplikationen der Lunge durch CO2-Inhalation und zervikale Verrenkungen vermeidet.
3. Entferne die Milz und gib sie in 2 ml 1x PBS. Legen Sie die Schläuche auf Eis. Achte darauf, die Instrumente mit Ethanol zwischen jedem Gewebe/Maus zu reinigen.
4. Homogenisieren Sie das Gewebe auf Eis, vorzugsweise mit Einweghomogenisatoren, die zwischen den einzelnen Probestückern ausgetauscht werden können. Einweg-Homogenisier-Spitzen können autoklaviert werden, um zwischen den Experimenten wiederverwendet zu werden.
5. Sobald das Gewebe homogenisiert ist, führen Sie serielle Verdünnungen durch und platten durchführen. Plattenproben eines bestimmten Gewebes/Verdünnungs dupliziert auf einer einzelnen tryptischen Soja-Agar-(TSA)-Platte, indem eine Trennlinie auf dem Kunststoff gezogen wird. Vorschläge zur Beschichtung und Verdünnung sind unten aufgeführt (in allen Fällen werden 10 μl Probe auf die Platte verteilt) und basieren auf einer 24-stündigen Obduktion nach der Infektion. Bei der Analyse von Proben von 48 bis 72 Stunden müssen möglicherweise mehr Verdünnungen verplattet werden, da die bakterielle Belastung zu späteren Zeitpunkten erhöht ist
   1. Für die Milz – verdünnen Sie 1:10-1:100, indem Sie 100 μl homogenisierte Milz in 900 μl steriles 1x PBS seriell hinzufügen. Platten sauber homogenisieren und beide Verdünnungen doppelt verdünnen.
6. Lassen Sie die Streuproben kurz trocknen.
7. Kehren Sie TSA-Platten um und legen Sie sie über Nacht in einen statischen Inkubator bei 37 °C.
8. Bestimmen Sie die Anzahl der kolonisierenden Bakterien, indem Sie die Bakterienkolonien auf beiden Seiten der Platte und aus jeder Verdünnung mitteln. Berücksichtigen Sie die anfänglichen Verdünnungen von 5 ml für die Lunge und 2 ml für die Milz, um die Gesamtgewebe-CFUs zu bestimmen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Prozedurboard für Aspirationspneumonie bei Mäusen. Studienmäuse werden mit dem Kopf nach oben und mit dem Rücken zum Brett positioniert (d. h. halb liegend), an den Schneidezähnen an einem Gummiband gespannt, das zwi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ATCC	43816
Becton Dickenson	211825
Intern vorbereitet	n/a	Destilliertes Wasser (5 l), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na₂HPO₄ (5,75 g), KH₂PO₄ (1 g)