Visualisierung von Aminosäuremetaboliten im Darmgewebe infizierter Mäuse

Zusammenfassung

Quelle: Specker, J. T. et al. Untersuchung der mikrobiellen Kooperation mittels bildgebender Massenspektrometrieanalyse von Bakterienkolonien, die während der Infektion auf Agar und im Gewebe gewachsen sind. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video demonstriert die Verwendung der matrixunterstützten Laser-Desorption/Ionisationsmassespektrometrie (MALDI), um die Aminosäureverteilung im Darmgewebe von Mäusen zu visualisieren, die mit Clostridioides difficile infiziert sind, allein oder in Kombination mit Enterococcus faecalis. Das Verfahren umfasst die Gewebevorbereitung, die Anwendung von Matrixen, die Laserionisation und den Nachweis von Aminosäureionen, um räumliche Ionenbilder zu erzeugen. Die Ergebnisse zeigen mikrobielle Kooperation, da E. faecalis die Darmumgebung verändert, indem es Ornithin freisetzt und Arginin abnimmt, wodurch die Pathogenese von C. difficile verbessert wird.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.

1. Vorbereitung und Versand von nicht infizierten Kontroll- und C. difficile-infizierten Maus-Cecal-Geweben
   1. Inokulieren Sie 4-8 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse mit Antibiotika (0,5 mg/mL Cefoperazon oder 0,5 mg/ml Cefoperazon + 1 mg/ml Vancomycin) in Trinkwasser ad libitum für 5 Tage, gefolgt von einer 2-tägigen Erholungsphase und anschließender Infektion.
   2. Eliminieren Sie die Tiere durch_{CO2-Erstickung} und entnehmen Sie sofort das Mäuse-Äxelorgan. Geben Sie eine 20%ige Mischung der optimalen Schneidetemperatur (OCT) in destilliertes Wasser ein.
   3. Legen Sie die Proben auf Trockeneis und verpacken Sie sie dann zur Analyse; Lagern Sie bei -80 °C bis zur Analyse.

 

2. Kryosektion nicht-infizierter Kontrolle gegenüber C. difficile-infizierten Maus-Müszekalgeweben

1. Reinigen Sie alle Kryosektionsgeräte, indem Sie sie mit 100 % Ethanol spülen und trocknen lassen, bevor Sie die Proben in die Kryostatkammer legen. Bereiten Sie ITO-beschichtete Objektträger mit einem Ohmmeter vor, um die Seite des Objektträgers mit leitfähiger Beschichtung zu identifizieren. Verwenden Sie einen diamantbesetzten Scribe, um die ITO-beschichtete Seite des Objektträgers zu ätzen und zu beschriften.
   HINWEIS: Geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Laborbrillen, Laborkittel und Kryostatenärmel, sollte getragen werden.
2. Führen Sie eine Kryosektion an einem Forschungskryomikrotom durch. Übertragen Sie das in OCT eingebettete Maus-Ceca-Gewebe aus einem -80 °C Gefrierfach in die Kryomikrotomkammer (30 °C Kammertemperatur, -28 °C Objekttemperatur) auf Trockeneis. Die zu vergleichenden Gewebeproben werden mit bildgebender Massenspektrometrie (z. B. nicht infizierte Kontrolle vs. C. difficile-infiziert) auf demselben Objektträger montiert, um eine identische Probenpräparation beider Gewebetypen sicherzustellen und genaue Metabolitenvergleiche zu ermöglichen.
3. Im Inneren der Kryomikrotomkammer wird das OCT-eingebettete Gewebe mit einer zusätzlichen OCT-Lösung auf einem Probenchuck montiert. Nachdem die OCT-Lösung gefestigt ist, befestigt man das Chuck am Probekopf. Beginnen Sie mit der Kryosektion in Schritten von 10–50 μm, um die gewünschte Gewebetiefe/Ebene des Organs zu erreichen.
4. Sobald ein optimaler Querschnitt des Gewebes erreicht ist, beginnen Sie mit dem Sammeln von Schnitten bei einer Dicke von 12 μm. Bearbeiten Sie die Scheibe vorsichtig mit Künstlerpinseln und legen Sie sie auf einen mit Teflon beschichteten Objektträger.
5. Rollen Sie den ITO-beschichteten Objektträger auf den Gewebeschnitt, um das Gewebe vom Teflon-beschichteten Objektträger aufzuheben. Tauen Sie das Gewebeteil am Objektträger an, indem Sie die Handfläche auf die Rückseite des ITO-beschichteten Objektträgers drücken. Tauen Sie die Halterung weiter auf, bis der Gewebeschnitt von durchsichtig zu einer decken/matten Textur übergeht.
6. Übertragen Sie die am Gewebe montierten Objektträger auf Trockeneis in eine Trockenbox mit Trockenmittel zur Lagerung für die Analyse am selben Tag oder lagern Sie bei -80 °C für längere Lagerung.

3. Vorbereitung nicht-infizierter Kontrolle gegen C. difficile-infizierte Maus-Mücealgewebe für die Matrixanwendung und MALDI-Bildgebende Massenspektrometrie

1. Durchführung der Anwendung der MALDI-Matrix (30 °C Düsentemperatur, acht Durchgänge, 0,1 mL/min, CC-Muster, 0 s Trocknungszeit, 10 psi).
2. Durchführung von MALDI-Bildgebungsmassenspektrometrie
3. Analysieren Sie die Ionenbilder mehrerer biologischer Replikaten und vergleichen Sie die Ergebnisse auf Signifikanz anhand von Intensitätsbox-Diagrammvergleichen mit der oben erwähnten SCiLS-Statistiksoftware.
   HINWEIS: Die geeigneten statistischen Tests und Vergleiche hängen von der Anwendung ab und können räumliche Segmentierung, Klassifikationsmodelle und vergleichende Analysen zur Bestimmung diskriminierender und korrelierter spektraler Merkmale umfassen. Vergleichende Analysen können die Zuordnung von p-Werten signifikanter Merkmale, die Erstellung von Hauptkomponentenanalysen für Gewebevergleiche und das Visualisieren von Box-Plots zur Identifizierung von Variationen umfassen. Es ist auch hilfreich, das Gewebe mittels einer Brightfield-Mikroskopie des mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Gewebeschnitts nach bildgebender Massenspektrometrie zu visualisieren. Dies ermöglicht eine klare Identifizierung morphologischer Merkmale im Gewebe und kann in Absprache mit einem ausgebildeten Pathologen analysiert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,2 μm Titan3 Nylon-Spritzenfilter	Thermowissenschaftlich	42225-NN
1,5-Diaminonaphthalin MALDI-Matrix	Sigma Aldrich	2243-62-1
20 ml Henke Ject Luer Lock-Spritzen	Henke Sass Wolf	4200.000V0
275i-Serie Konvektions-Vakuummessgerät	Kurt J. Lesker Firma	KJL275807LL
7T SolarX FTICR Massenspektrometer ausgestattet mit einem Smartbeam II Nd:YAG MALDI Lasersystem (2 kHz, 355 nm)	Bruker Daltonics
Essigsäurelösung, geeignet für HPLC	Sigma Aldrich	64-19-7
Acetonitril, geeignet für HPLC, Gradientengrad, ≥99,9 %.	Sigma Aldrich	75-05-8
Ammoniumhydroxidlösung, 28 % NH3 im H2O, ≥99,99 % Spurenmetallbasis,	Sigma Aldrich	1336-21-6
Autoklavable Biohazard-Beutel: 55 Gallonen	Grainger	45TV10
Transportsäcke für Biohazard-Proben (8 x 8 Zoll)	Fisher Scientific	01-800-07
Hirn-Herz-Infusionsbrühe	BD Biosciences	90003-040
C57BL/6 männliche Mäuse	Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II Foto- und Dokumentenscanner	Kanon
CM 3050S Forschungskryomikrotom	Leica Biosystems
Desiccator-Kabinett	Sigma Aldrich	Z268135
Diamantspitzenschreiber, Elektronenmikroskopiewissenschaften	Fisher Scientific	50-254-51
Dryrit-Desiccant-Pellets	Drierit	21005
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2701
flexImaginging-Software	Bruker Daltonics
ftmsControl-Software	Bruker Daltonics
Glasvakuumfalle	Sigma Aldrich	Z549460
HTX M5 TM Robotersprüher	HTX Technologies
Indiumzinnoxid (ITO)-beschichtete Mikroskopobjektträger	Delta Technologies	CG-81IN-S115
Inline-HEPA-Filter zur Vakuumpumpe	LABCONCO	7386500
Methanol, HPLC-Qualität	Fisher Chemical	67-56-1
MTP-Schiebeadapter II	Bruker Daltonics	235380
Optimale Schneidetemperatur (OCT) Verbindungsmasse	Fischer Scientific	23-730-571
Peridox RTU Sporizid, Desinfektionsmittel und Reiniger	CONTEC	CR85335
PTFE (Teflon) gedruckte Objektträger, Elektronenmikroskopiewissenschaften	VWR	100488-874
Rotationsflügel-Vakuumpumpe RV8	Edwards	A65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Einweg-Mikrotom-Klingen mit hohem Profil	Elektronenmikroskopiewissenschaften	63068-PS
Transparentes Vakuumrohr	Cole Palmer	EW-06414-30
Ultragrade 19 Vakuumpumpenöl	Edwards	H11025011
Variabler Spannungstransformator	Powerstat
Wasser, geeignet für HPLC	Sigma Aldrich	7732-18-5
Weitmündige Dewar-Flasche	Sigma Aldrich	Z120790