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1. Bewertung der Wirkung von Kleinmolekülinhibitoren auf die Bildung von Pellicle- und Biofilmkolonien
- Bereiten Sie eine 2x-Lösung eines definierten biofilminduzierenden MSgg (Mononatriumglutamat-Glycerol) Mediums ohne Calciumchlorid und Eisen(III)chlorid-Hexahydrat vor. Nach der Filtersterilisation wird das Calciumchlorid hinzugefügt. Das Medium ist direkt einsatzbereit oder kann bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.
- Bereite die 1x MSgg-Verdünnung am Tag des Experiments vor.
- Verdünnen Sie das 2x MSgg-Medium auf 1x mit sterilem destilliertem Wasser (Pellicles) oder sterilem 3 % heißem (80 °C) Agar (Biofilm) und fügen Sie Eisen(III)chlorid-Hexahydrat zu einer Endkonzentration von 50 μM (Pellicles) oder 250 μM (Biofilme) hinzu. Fügen Sie Antibiotika oder Kleinmolekülhemmer zur gewünschten Konzentration hinzu und mischen Sie sie gut. Um beispielsweise eine Endkonzentration von 0,5 mM D-Leucin in 30 ml zur Bildung von Pelliklen oder Biofilmen zu erhalten, fügen Sie 196,6 μl einer 76,3 mM (10 mg/ml) D-Leucin-Stocklösung hinzu.
HINWEIS: Die endgültige 1x MSgg-Komposition ist in Tabelle 1 beschrieben. Im Vergleich zum ursprünglichen Rezept enthielt das Medium 50 μg/ml Threonin, und die Eisenkonzentration für Biofilmkolonien auf festem MSgg-Medium wurde um das 2,5-fache erhöht, um die Faltenmorphologie der Kolonie zu optimieren.
- Nach der Verhärtung des Agar werden die festen MSgg-Platten 30–45 Minuten vor der Impfung in einer biologischen Haube getrocknet.
- Um spezifische Inhibitoren auszuwählen, die die Mechanismen der Pellicle-Bildung beeinträchtigen (Abbildung 1), schließen Sie aus, dass die verwendeten Konzentrationen das planktonische und statische Wachstum beeinflussen.
- Bestimmen Sie das planktonische Wachstum (Zunahme der optischen Dichte über die Zeit in der Flüssigkeitskultur) in einer einfachen Wachstumskurve, indem Sie die optische Dichte bei 600 nm pro Stunde bis zur stationären Wachstumsphase messen.
- Um zu bestätigen, dass die gemessene Kulturtrübung die lebenden Zellzählungen darstellt, bestimmen Sie die Anzahl der Koloniebildungseinheiten (CFU) von Zellen in der planktonischen Wachstumsphase aus einer Schüttelkultur zu mehreren Zeitpunkten.
- Um die Wirkung von Kleinmolekülinhibitoren auf das statische Pellikelwachstum zu bewerten, entnehmen Sie Zellen am Ende einer dreitägigen Inkubation bei 23 °C aus einem 24-Wellen-Zellkulturbrunnen, der unter denselben Bedingungen wie in den Abschnitten 1.7-1.9 beschrieben impft wurde, und bestimmen die CFU. Für diese Kontrolle wird eine pellicle-defiziente Spannung verwendet, die die Operonen für die extrazellulären Matrixkomponenten nicht besitzt (d. h. B. subtilis ΔepsH, ΔtasA).
HINWEIS: Dieser Stamm kann unter statischen Bedingungen wachsen, ist jedoch im Gegensatz zu einem Pellicle-bildenden Wildtyp unfähig, bis zur Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche zu schwimmen, wo das Wachstum aufgrund erhöhter Sauerstoffwerte begünstigt wird. Daher ist dieser extrazelluläre Matrix- und Pellicle-Defizient-Stamm ein empfohlener Referenzstamm zur Beurteilung des Wachstums unter statischen Bedingungen.
HINWEIS: Für das spezifische Beispiel der unten beschriebenen nicht-kanonischen D-Aminosäure D-Leucin wurde ein Effekt auf planktonisches und statisches Wachstum bei Konzentrationen, die die Pellikelbildung störten, ausgeschlossen. Die Methoden zur Bestimmung des planktonischen und statischen Wachstums sind ausführlich beschrieben.
- Entfernen Sie B. subtilis aus einem -80 °C Bestand (LB-Kultur von 109 Zellen /ml eingefroren in 20 % Glycerol), um einzelne Kolonien auf einer LB-1,5 % Agarplatte mit steriler Spitze oder Applikatorstab zu isolieren.
- Über Nacht bei 30 °C anbauen.
- KRITISCHER SCHRITT: Für eine robuste Pellicle-Hemmung durch nicht-kanonische D-Aminosäuren wie D-Leucin wird eine einzelne Kolonie aus der LB-1,5%-Agarplatte in 3 ml LB-Brühe bei 37 °C für 4 Stunden in einem Schüttelinkubator (Schüttelgeschwindigkeit 200 U/min) gezogen. Ersetzen Sie die LB-Brühe vor der Impfung durch biofilminduzierendes MSgg-Medium, indem Sie eine 1,5-ml-Starterkultur für 4 Minuten bei 6.000 x g zentrifugieren, das Supernatant vorsichtig entfernen und das Pellet in 1,5 ml MSgg-Medium neu suspendieren. Der Rest der Kultur kann verworfen werden. Wichtig: Um die Robustheit des Systems zu gewährleisten, sollte die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der gewaschenen Starterkultur zwischen 0,6 und 1 liegen.
- Während des Wachstums der Starterkultur bereiten Sie eine 12-Well-Zellkultur-Mehrschichtplatte mit 3 ml MSgg-Medium ohne oder mit einem Konzentrationsbereich des kleinen Molekülinhibitors (z. B. 0,3, 0,5, 1 mM D-Leucin) vor. Um Kanteneffekte auszuschließen, verteilen Sie die Lage der unterschiedlichen Konzentrationen auf der Mehrfachplatte. Alternativ verwenden Sie 24-Well-Zellkulturplatten mit 1,5 ml MSgg-Medium.
- Inokulieren Sie die Brunnen der 12-Bohrloch-Zellkultur-Mehrschichtplatte mit 3 μl der gewaschenen Starterkultur (1:1.000 Verdünnung).
HINWEIS: Ein niedrigeres Verdünnungsverhältnis, also 1:500, kann verwendet werden. Dies verringert die Entwicklungszeit der Pellikel. - Wachsen Sie die Pellicles drei Tage lang bei 23 °C unter statischen Bedingungen. Bewegen Sie die Pellikel in dieser Zeit nicht, da dies die endgültige Oberflächenmorphologie des Pellikels beeinflussen kann.
- Fotografieren Sie mit einem Fernglas und eine homogene Belichtung von Blitzen. Alternativ können Sie mit einer hochauflösenden Kamera ein Foto der Pellicles machen. Um Artefakte durch ungleichmäßige Lichtwinkel und Schatten zu vermeiden, machen Sie Draufsichtsaufnahmen mit der Kamera auf einem Stativ und verwenden Sie eine weiche, große Lichtquelle bei 45° Entfernung von beiden Seiten.
HINWEIS: Eine alternative Methode zur Untersuchung der B. subtilis-Mehrzelligkeit ist der Biofilm-Kolonie-Test auf festem, biofilminduzierendem MSgg-Medium. Wie bei Pelliklen ermöglicht auch dieser Test die Untersuchung raumzeitlicher Prozesse. Sobald der Wirkungsbereich von Kleinmolekülinhibitoren bestimmt ist, können deren Einfluss auf die Bildung von Biofilmkolonien untersucht werden. - Um Biofilmkolonien zu züchten, platzieren Sie symmetrisch 1,5 μl der ungewaschenen Vorkultur (Schritt 1.7) auf der getrockneten MSgg 1,5%-Agarplatte mit Hilfe einer Schablone – 4 Tropfen pro Petrischale mit 8,5 cm Durchmesser. Lassen Sie die Tropfen auf die Platte einziehen, bevor Sie sie bewegen.
HINWEIS: Die Vorlage hilft, eine gleichmäßige Verteilung der Biofilmkolonien innerhalb des Bereichs zu erreichen, in dem die Zellen wachsen. Um die Vorlage vorzubereiten, zeichnen Sie die gesamte Wachstumsfläche im ursprünglichen Maßstab, teilen sie in gleiche Sektoren und markieren Sie das Zentrum. Für eine runde Petrischale mit 8,5 cm Durchmesser ergibt dies 14 cm2 zu einer Biofilmkolonie. - Inkubieren Sie die Platten drei Tage lang bei 30 °C. In dieser Zeit entwickeln sich Biofilmkolonien und bilden eine dreidimensionale, faltige Struktur.
- Mach Fotos wie in Schritt 1.11.
Tabelle 1. Abschließende 1x MSgg-Komposition in dieser Studie.
| 1,925 mM | Kaliumphosphat-Monobas |
| 3,075 mM | Kaliumphosphat-dibasisch |
| 100 mM | 3-(N-morpholino)Propansulfonsäure, pH 7,1 |
| 2 mM | Magnesiumchloridhexahydrat |
| 700 μM | Calciumchlorid wasserfrei |
| 50 μMa | Eisen(III)chlorid-Hexahydrat |
| 125 μMb |
| 1 μM | Zinkchlorid wasserfrei |
| 2 μM | Thiaminhydrochlorid |
| 50 μg/ml | Tryptophan |
| 50 μg/ml | Phenylalanin |
| 50 μg/ml | Threonin |
| 0,5 % (v/v) | Glycerol wasserfrei |
| 0,5 % (w/v) | L-Glutaminsäure-Mononatrium-Salzhydrat |
| Afür Pellicle-Assay; bfür Biofilm-Assay |
