Ethanolresistenztest zur Bewertung der Integrität der Biofilmmatrix

Zusammenfassung

Quelle: Bucher, T. et al. Methodologien zur Untersuchung von B. subtilis-Biofilmen als Modell zur Charakterisierung kleiner Molekül-Biofilminhibitoren. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt, wie die Integrität der Biofilmmatrix die bakterielle Resistenz gegen Ethanol beeinflusst, indem es koloniebildende Einheiten in unbehandelten und inhibitorgestörten Biofilmen vergleicht. Reduzierte CFUs in inhibitorbehandelten Proben zeigen, dass die extrazelluläre Matrix unerlässlich ist, um biofilmeingebettete Zellen vor antimikrobieller Belastung zu schützen.

Protokoll

1. Ethanolresistenztest

1. Wachsen Sie Biofilme und schneiden Sie nach 68 Stunden Wachstum bei 30 °C die Biofilmkolonien mit Hilfe einer Rasierklinge und der Vorlage in zwei gleiche Teile.
2. Heben Sie vorsichtig jede Hälfte der Biofilmkolonie mit einem kleinen Pfannenwender von der Agarplatte ab und bringen Sie sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 500 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Falls nötig, kratzen Sie die verbleibenden Zellen von der Platte ab und übertragen sie ebenfalls in das Mikrozentrifugenrohr.
   HINWEIS: Die zweite Hälfte der Biofilmkolonie wird unterschiedlich behandelt, je nachdem, ob es sich um die Kontrolle handelt oder um die Resistenz gegen Sterilisationsmittel zu testen.
3. Zur Kontrolle wird die zweite Hälfte der Biofilmkolonie in 500 μl PBS inkubiert. Um die Resistenz gegen Sterilisationsmittel zu bewerten, wird die zweite Hälfte der Biofilmkolonie auf 500 μl 50% (v/v) Ethanol übertragen.
   HINWEIS: Alternative Sterilisationsmittel wie Natriumhypochlorit können verwendet werden. Für alle verwendeten Sterilisationsmittel bestimmen Sie in einem vorläufigen Experiment die aktive Konzentration und die Inkubationszeit.
4. Inkubieren Sie die Biofilmkolonien 10 Minuten lang auf der Arbeitsplatte bei Zimmertemperatur.
5. Zentrifugiere die Biofilmkolonien für 5 Minuten bei 18.000 x g und entferne vorsichtig den Überstandsstoff mit einer Pipette. Fügen Sie 300 μl PBS hinzu.
6. Sonikieren Sie die Zellen leicht (Amplitude 10 %, Puls 5 Sekunden) mit der Mikrospitze eines Sonikators.
   HINWEIS: Die Sonikationsenergie muss ausreichen, um Biofilmaggregate zu trennen. Allerdings kann zu starke Sonikation die Zellen lysieren. Bestätigen Sie im Voraus mittels Lichtmikroskopie, dass die verwendete Sonikationsenergie die Zellen nicht lysiert und alle Aggregate aufgelöst sind.
7. Fügen Sie 700 μl PBS zu einem Endvolumen von 1 ml hinzu. Führen Sie eine serielle Verdünnung (auf ^10-7) in PBS durch und verteilen Sie 100 μl von 3 Verdünnungen auf einer LB-1,5%-Agarplatte mit sterilen Glasperlen.
   HINWEIS: Die optimalen Verdünnungen, die plattiert werden sollen, sollten in einem vorläufigen Versuch bestimmt werden, da dies von der Anzahl der Zellen in der interessierenden Biofilmkolonie und der Überlebensrate der Zellen als Reaktion auf das sterilisierende Mittel abhängt.
8. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 30 °C, zählen Sie die CFU und bestimmen Sie CFU/ml. Aus dem finalen CFU/ml jeder halben Biofilmkolonie berechnet man den Prozentsatz der Überlebenden.
   HINWEIS: Wenn sie wie beschrieben durchgeführt und analysiert werden, sollten die beiden Hälften der Kontrollbiofilmkolonie und die unbehandelte versus ethanolbehandelte Hälfte der Biofilmkolonie Unterschiede unter 10 % bei den lebensfähigen Zellzahlen aufweisen, was die Symmetrie bzw. die Resistenz der Kolonie bestätigt. Alternativ können die Ergebnisse in Gesamt-CFU dargestellt werden. Die Zellzahlen der Kontroll- und unbehandelten Biofilmkolonie sollten in derselben Größenordnung bleiben. Im Gegensatz dazu wird erwartet, dass die Zellzahlen der ethanolbehandelten Hälfte einer mit kleinen Molekülen behandelten Biofilmkolonie um mindestens zwei Größenordnungen sinken, um eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem sterilisierenden Mittel zu bestätigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Luria-Brühe, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
Kaliumphosphat-Monobas	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G
Kaliumphosphat-dibasisch	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
3-(N-morpholin)Propansulfonsäure	Fisher Scientific, 209,27 g/mol	BP308-500
Magnesiumchloridhexahydrat	Merck, 203,30 g/mol	1.05833.0250
Calciumchlorid wasserfrei	J.T. Baker, 110,98 g/mol	1311-01
Mangan(II)chlorid-Tetrahydrat	Sigma, 197,91 g/mol	31422-250G-R
Eisen(III)chlorid-Hexahydrat	Sigma, 270,30 g/mo)	F2877-500G
Zinkchlorid wasserfrei	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
Thiaminhydrochlorid	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-Tryptophan	Fisher Scientific, 204,1 g/mol	BP395-100
L-Phenylalanin	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-Threonin	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
Glycerol wasserfrei	Bio-Lab Itd	712022300
L-Glutaminsäure-Mononatriumsalze hydratisieren	Sigma, 169,11 g/mol	G1626-1KG
D-Leucin	Sigma, 169,11 g/mol	855448-10G
Ethanol wasserfrei	Gadot	830000054
Rasierklinge	Eddison	NA
Kreisförmige Zellulosefilterpapiere	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldehyd	EMS (Elektronen-Mikoskopie-Wissenschaft), 25 % im Wasser	16220
Paraformaldehyd	EMS, 16 % im Wasser	15710
Natriumkakodylat	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Calciumchlorid-2-hydrat	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Shaker 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Zentrifuge	Eppendorfer Tischzentrifuge 5424	NA
Digitaler Sonifier, Modell 250, verwendet mit Double Step Microtip	Branson	NA
Inkubator 30 °C	Ordner	NA
Inkubator 23 °C	Ordner	NA
Filtersystem, 500 ml, Polystyrol	Cornig Incorporated	NA
Rotationsschüttler – Orbitron Rotatory II	Boekel	NA