Vorbereitung bakterieller Biofilmkolonien für morphologische Analyse

Zusammenfassung

Quelle: Bucher, T., et al., Methodologien zur Untersuchung von B. subtilis-Biofilmen als Modell zur Charakterisierung kleiner Molekül-Biofilminhibitoren. J. Vis. Exp.(2016)

Dieses Video demonstriert die Vorbereitung ausgewachsener bakterieller Biofilmkolonien für hochauflösende Bildgebung. Es behandelt Fixierung, Dehydration, Montage und Metallbeschichtungsschritte, um die Biofilmmorphologie zu erhalten und zu visualisieren.

Protokoll

Biofilm-Kolonie-Probenvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie

1. Bakterielle Biofilmkolonien wachsen lassen.
2. Bereiten Sie eine frische Charge mit 2% (v/v) Glutaraldehyd, 3% (v/v) Paraformaldehydlösung in 100 mM Natriumkakodylat vor, 5 mM Calciumchloridpuffer, pH 7,3. Bereiten Sie für jede Petrischale mit 8,5 cm Durchmesser 5 ml Fixativ vor.
   VORSICHT: Glutaraldehyd und Paraformaldehyd sind gefährlich. Behandeln Sie sie mit Schutzausrüstung in einer chemischen Haube. Entsorgen Sie die Lösungen und die kontaminierten Materialien im gefährlichen Abfall.
3. Fügen Sie das Fixativ vorsichtig zu den Biofilmkolonien hinzu, ohne es direkt auf die Biofilme zu geben.
   HINWEIS: Aufgrund des hydrophoben Charakters der Biofilmkolonie lösen sich die Kolonien langsam vom Agar und beginnen zu schweben.
4. Versiegeln Sie die Platten sorgfältig mit einem Streifen Parafilm. Inkubieren Sie 2 Stunden lang auf einem Rotationsschüttler bei Raumtemperatur und übertragen Sie die Platten anschließend über Nacht auf 4 °C.
5. Am nächsten Tag entferne die Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pasteur-Pipeette, die an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist.
6. Fügen Sie vorsichtig 10 ml 100 mM Natriumkakodylat hinzu, 5 mM Calciumchloridpuffer, um den Biofilm zu waschen, und inkubieren Sie 5 Minuten. Entferne die Flüssigkeit vorsichtig mit der Pasteur-Glaspipette aus der Ecke der Platte, um den Biofilm nicht zu beschädigen, und gib eine frische Waschlösung durch sanftes Pipettern hinzu. Wiederhole diesen Schritt einmal.
7. Zur Dehydrierung der Biofilmkolonien werden folgende Schritte durchgeführt: 2x 5 Minuten bei ddH₂O; 2x 20 Minuten in 30 % Ethanol; 2x 20 Minuten in 50 % Ethanol; 2x 20 Minuten in 70 % Ethanol; 2x 20 Minuten in 96 % Ethanol; 2x 30 Minuten in 100% Ethanol.
   1. Gib in jedem Schritt 15 ml Flüssigkeit für jede Petrischale mit 8,5 cm Durchmesser hinzu und entferne die Flüssigkeit nach jeder Inkubation vorsichtig.
8. Verwenden Sie eine von zwei verschiedenen Methoden, um die Proben aus Ethanol zu trocknen.
   1. Zum Lufttrocknen aus Ethanol:
      1. Schneiden Sie ein Zellulosefilterpapier (Durchmesser 9 cm) in Viertel. Tauchen Sie kurz ein Viertel in 100 % Ethanol und übertragen Sie dann vorsichtig eine schwimmende Biofilmkolonie darauf. Legen Sie das Nassfilterpapier in eine Petrischale, die mit Filterpapier ausgekleidet ist. Decken Sie die Petrischale ab und lassen Sie die Biofilmkolonien über Nacht in einer chemischen Haube trocknen.
9. Beschichten Sie einen Elektronenmikroskopie-Stummel mit Kohleband. Mit Hilfe einer Pinzette werden die Biofilmkolonien vorsichtig auf den Stummel übertragen. Verbinden Sie jede Kolonie mit dem Stub, indem Sie eine dünne Brücke aus Kohlenstoffband hinzufügen, was für die Ladungsbeseitigung unter dem Elektronenstrahl entscheidend ist. In diesem Stadium sollten Sie die Biofilmkolonien vorsichtig behandeln, da sie sehr empfindlich sind. Bewahren Sie die Proben mindestens 24 Stunden oder bis zur Untersuchung in einem Desikator auf.
10. Am Tag der Untersuchung wird mit dem Rasterelektronenmikroskop (SEM) die Biofilmkolonien 2 Minuten lang in einem Gold-Palladium-Sputter-Coater in einem Gold-Palladium-Sputter-Coater beschichtet. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal und drehen Sie die Proben um 120° dazwischen. Am Ende sputter-coaten Sie die Proben einmal für 3 Minuten von oben. Die 20 nm dünne Schicht Gold-Palladium verbessert die Leitfähigkeit und erhöht den Kontrast der Probe für die Bildgebung in der Rasterelektronenmikroskopie.
11. Bewahren Sie die Proben in einem Desiccator auf, um eine Rehydrierung der Probe bis zur Bildaufnahme mit einem Rasterelektronenmikroskop zu vermeiden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Glycerol wasserfrei	Bio-Lab Itd	712022300
Ethanol wasserfrei	Gadot	830000054
Rasierklinge	Eddison	NA
Kreisförmige Zellulosefilterpapiere	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldehyd	EMS (Elektronen-Mikoskopie-Wissenschaft), 25 % im Wasser	16220
Paraformaldehyd	EMS, 16 % im Wasser	15710
Natriumkakodylat	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Calciumchlorid-2-hydrat	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Stub-Aluminium-Halterung	EMS, Schlitzkopf	75230
Kohleklebeband	EMS	77825-12
Shaker 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Inkubator 30 °C	Ordner	NA
Inkubator 23 °C	Ordner	NA
Rotationsschüttler – Orbitron Rotatory II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
Umwelt-Rasterelektronenmikroskop	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA