Eine Kammerabdeckungsglas-Methode zur In-vitro-Bakterienbiofilmbildung

Zusammenfassung

Quelle: Beaudoin, T., et al. Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf die Biofilmentwicklung mit einem Kammer-Coverglass-Modell. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert die Verwendung eines kammerbasierten Deckglases zur Untersuchung der Auswirkungen von Patienten durch Mukoviszidose abgeleiteten Spötterwirtsfaktoren auf die Entwicklung bakterieller Biofilme.

Protokoll

Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden gemäß den Richtlinien des IRB des Instituts durchgeführt.

1. Kammer-Deckglas-Methode zur Biofilmbildung
   1. Pflanze über Nacht ein interessantes bakterielles Isolat in gewünschtem Medium bei 37 °C mit Schütteln (200 U/min) an.
      HINWEIS: Es wurden verschiedene Bakterien verwendet, darunter klinische Isolate wie Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia-Komplex und Achromobacter xylosoxidans. Die Wahl des Mediums hängt von den Stämmen und den Interessenbedingungen ab, jedoch können (Luria-Brühe) LB-Medien für erste Experimente verwendet werden.
   2. Aus der Übernachtkultur werden 40 μl Kultur in 4 ml frisches Medium gegeben und 3–4 Stunden bei 37 °C mit Schütteln (200 RPM) gewachsen, um eine Kultur mit einer optischen Dichte von 600 nm (OD600) von etwa 0,5–0,6 zu erhalten.
   3. Verdünnen Sie die Kultur von Schritt 1,2 auf 1/5 im gewünschten Medium mit 10 % Sputumfiltrat oder ohne Sputumfiltrat (als Kontroll). Andere Konzentrationen des Sputumfiltrats können getestet werden (d. h. 50 % oder 100 %).
   4. Verwenden Sie 200 μl der Verdünnung, um Brunnen von Schlittenkammern zu säen.
   5. Lass die Bakterien 4 Stunden bei 37 °C ohne Zittern anhaften.
   6. Nach 4 Stunden entferne ich das Medium und wasche den Biofilm vorsichtig mit 1x frischem Medium. Ersetze sie durch 200 μl frisches Medium.
      HINWEIS: Um die Auswirkungen von Sputum auf den Biofilm zu untersuchen, sollte das frische Medium einen Sputum-Supernatant enthalten.
   7. Biofilme lassen Sie die gewünschte Zeit bei 37 °C ohne Schütteln wachsen, ersetzen Sie das Medium alle 12 Stunden, ohne zu waschen, bis zur Mikroskopie.
      HINWEIS: Um die Wirkung von Sputum-Supernatanten auf die Anfälligkeit für Biofilm-Antibiotika zu untersuchen, werden Antibiotika nach 24 Stunden Biofilmwachstum in das Medium gegeben und bis zur Färbung und Bildgebung der Biofilme im Medium gehalten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lab-Tek II Kammer-Deckglas, #1,5 Borosilikat, 8-Bohrloch	Thermo Sicher Scientific	155409
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standardmedien für Übernachtwachstum/Biofilmwachstum