Konfokale Bildgebung bakterieller Biofilme, indusert durch Sputumfiltrate von Mukoviszidose-Patienten

Zusammenfassung

Quelle: Beaudoin, T., et al. Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf die Biofilmentwicklung mit einem Kammer-Coverglass-Modell. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert eine in-vitro-Methode , um zu untersuchen, wie patientenabgeleitetes Mukoviszidose-Sputum die bakterielle Biofilmbildung beeinflusst. Durch Verwendung von Kammerobjektträgern, fluoreszierender Färbung und konfokaler Mikroskopie zeigt es eine erhöhte Dicke, veränderte Architektur und eine höhere lebensfähige Biomasse in mit Sputum angebauten Biofilmen, was die Rolle der Wirtskomponenten bei der Gestaltung der Biofilmentwicklung hervorhebt.

Protokoll

Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden gemäß den Richtlinien des IRB des Instituts durchgeführt.

Färbungsbiofilme und Konfokalmikroskopie

1. Nach der gewünschten Wachstumszeit (am besten geeignete 24–48 Stunden) entfernen Sie das Medium aus den Kammerbrunnen und waschen Sie jede Kammer vorsichtig zweimal mit 300 μl sterilem PBS.
2. Bereiten Sie die Färbungsmischung für Biofilm vor, indem Sie 1 μl jedes Farbstoffs (im Viabilitätskit) für jede benötigte ml Lösung mischen. Stellen Sie Farbe in Wasser oder Medienlösung her.

HINWEIS: Wasser wird vom Hersteller empfohlen.

3. Geben Sie 200 μl Farbstoffmischung zu jedem Brunnen des kammerbasierten Deckglases und inkubieren Sie 45 Minuten bei Raumtemperatur, im Dunkeln.
4. Entfernen Sie die Färbungsmischung aus den Kammern und waschen Sie jeden Brunnen mit 300 μl sterilem PBS. Entfernen Sie PBS und ersetzen Sie es durch frisches Wasser oder Medien.
5. Fahren Sie mit der Visualisierung von Biofilmen mittels Konfokalmikroskopie fort.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lab-Tek II Kammer-Deckglas, #1,5 Borosilikat, 8-Bohrloch	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standardmedien für das nächtliche Wachstum von Gowth/Biofilm
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Waschen von Biofilmkammern nach der Entfernung des Mediums
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss