Modellierung von Darminfektionen bei Zebrafischlarven unter Verwendung lebensmittelbedingter Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Flores, E., et al. Verwendung des protozoen Paramecium caudatum als Vehikel für lebensmittelbedingte Infektionen bei Zebrafischlarven. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert die Methode, ein lebensmittelbedingtes bakterielles Darminfektionsmodell bei Zebrafischlarven zu etablieren, indem man ihnen Paramecia füttert, die mit fluoreszierendem E. coli infiziert sind.

Protokoll

1. Nahrungsmittelbedingte Infektion von Zebrafischen
   1. Inkubiere Bakterien mit Paramecia.
      1. Bereiten Sie in der Nacht vor der Infektion eine Kokultur von Paramecium caudatum und Escherichia coli MG1655 vor. Kombinieren Sie 8 ml E3-Medien, 1 ml einer laufenden Paramecia-Kultur und 1 ml einer E. coli MG1655-Kultur (OD₆₀₀ = 1,0), die in 1x E3 in T25-Gewebekulturkolben resuspendiert sind. Inkubieren Sie die Flaschen über Nacht bei Zimmertemperatur (RT). Für jede Behandlungsbedingung bereiten Sie zwei Flaschen Paramecia vor.
      2. Inokulieren Sie das bakterielle Wachstumsmedium (LB (Lysogeny Fellh): 1 g/L Tryptone, 0,5 g/L Hefeextrakt, 1 g/L NaCl) mit dem infektiösen Bakterienstamm, indem Sie eine einzelne Bakterienkolonie von einer Platte mit einer sterilen Inokulationsschleife abnehmen. Die Flüssigkeitskultur bei 37 °C inkubieren und über Nacht mit 110 Umdrehungen pro Minute (rpm) schütteln lassen.
         HINWEIS: Persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel und Handschuhe) sollte getragen werden, und Biosicherheits-Level-2-Einrichtungen sollten beim Umgang mit Infektionserregern verwendet werden.
      3. Am nächsten Tag misst man den OD₆₀₀ der Übernachtkultur. Berechnen Sie das Kulturvolumen, das benötigt wird, um ein OD600 von 1 zu erreichen, wenn es in 11 mL Medium aufgehängt wird.
      4. Man entnimmt das Bakterienvolumen durch Zentrifugation bei 6.000 x g für 5 Minuten, ein Volumen pro Flasche Paramecia. Entsorgen Sie das Überstandsmittel und suspendieren Sie das bakterielle Pellet in 1 ml E3-Medien.
      5. Optional kann man die Bakterien mit einem fluoreszierenden Farbstoff vorfärben.
         1. Fügen Sie 1 μL FM 4-64FX bakterielle Färbung (5 mg/mL Stocklösung) hinzu. Decke das Rohr mit Folie ab, um vor Photobleaching zu schützen, und inkubiere, während du dich 15 Minuten lang bei RT (RT) drehst.
         2. Entfernen Sie überschüssige Farbstoffe durch Waschen mit 1x E3: Pelletbakterien durch Zentrifugation bei 6.000 x g für 1,5 Minuten auflösen und anschließend das Pellet in 1 ml E3-Medium neu suspendieren. Wiederhole den Waschschritt zweimal.
         3. Ernte gefärbte Bakterien mittels Cntrifugation bei 6.000 x g für 5 Minuten. Entsorgen Sie das Überstandsmittel und suspendieren Sie das bakterielle Pellet in 1 ml E3-Medien.
      6. Geben Sie 1 ml der bakteriellen Suspension zu jeder der beiden Flaschen mit frischer Paramecia. Inkubiere 2 Stunden im RT.
         HINWEIS: Wenn Sie mit gefärbten Bakterien arbeiten, inkubieren Sie im Dunkeln bei RT für 2 Stunden
2. Bakterien-/Paramecia-Kokultur waschen
   1. Kombinieren Sie den Inhalt beider Kolben mit Paramecia/Bakterien in einem 50-mL konischen Rohr. Zentrifugiere Proben bei 300 x g bei 15 °C für 10 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge vor diesem Schritt vorgekühlt ist.
   2. Entfernen Sie etwa 10 ml des E3-Supernatanten mit einer serologischen Pipette und geben Sie etwa 10 ml frisches 1x E3 in das konische Rohr.
      HINWEIS: Bei allen Waschschritten ist es wichtig, das Supernatant sehr schnell zu entfernen, da die Paramecia dann aus dem Pellet herausschwimmt. Drehen und entfernen Sie das Supernatant einzeln aus dem Rohr, um in diesem Schritt eine schnelle Handhabung zu gewährleisten und den Verlust der Paramecia im Supernatant zu vermeiden.
   3. Proben werden durch Zentrifugation bei 300 x g bei 15 °C für 5 Minuten gedreht. Entfernen Sie etwa 10 ml des E3-Supernatanten mit einer serologischen Pipette und geben Sie etwa 10 ml frisches 1x E3 in das konische Rohr. Wiederhole diesen Schritt zweimal.
   4. Zentrifugiere Proben mit 300 x g bei 15 °C für 5 Minuten. Entferne etwa 10 ml des E3-Supernatanten und achte darauf, das Pellet nicht zu stören.
   5. Das Pellet wird in die verbleibenden 10 mL E3-Medium wieder suspendiert und 500 μL der Suspension in ein neues 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr übertragen. Pelletiere die 500 μL Paramecia durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten, um die Anzahl der Paramecia zu zählen.
   6. Entfernen Sie 400 μL des E3-Supernatanten aus der 500-μL-Probe. Fügen Sie 20 μL 36,5%ige Formaldehydlösung zu den verbleibenden 100 μL Paramecia hinzu, suspendieren Sie es vorsichtig wieder und inkubieren Sie 5 Minuten bei 22 °C.
      HINWEIS: Dieser Schritt tötet die Paramecia, um das Zählen zu ermöglichen.
   7. Misse das tatsächliche Gesamtvolumen mit der Pipette und nimm auf. Verdünne die Paramecia-Suspension 1:1 v/v mit 0,4 % Trypan-Blau-Lösung.
   8. Verwenden Sie einen Zellzähler oder ein Hämozytometer, um die Anzahl der toten Paramecien/mL zu zählen.
      HINWEIS: Aufgrund des vorherigen Fixierungsschritts sind die meisten Paramecia zu diesem Zeitpunkt tot, aber diese Zahl spiegelt die Anzahl der lebenden Paramecien für das Co-Inkubationsexperiment wider. Die Autoren haben keinen signifikanten Paramecia-Tod durch bakterielle Ko-Inkubation festgestellt, daher kann dies hier als Faktor außer Acht gelassen werden.
3. Gemeinsame Raupen von Paramecia und Zebrafischen
   1. Berechnen Sie die Konzentration von Paramecia im 50-mL konischen Rohr
   2. Berechnen Sie das Volumen gewaschener Paramecia, das für eine Konzentration von 2 x 10⁵ Paramecia/mL in einem Endvolumen von 3 mL E3 erforderlich ist.
      HINWEIS: Die Konzentration von Paramecia kann anhand der gewünschten bakteriellen Dosierung angepasst werden, die der Optimierung unterliegt.
   3. Betäuben Sie Zebrafische durch Zugabe von Tricain in 100 mM Tris pH 8,0 bis zu einer Endkonzentration von 100 mg/L. Übertragen Sie 10 Zebrafische in jede Mulde einer 6-Well-Platte in ein Gesamtvolumen von 3 mL frisches E3 mit der entsprechenden Konzentration an Paramecia. Stellen Sie sicher, dass die Larven in einer minimalen Menge Flüssigkeit transportiert werden, damit sie sich im Empfänger von der Narkose erholen.
   4. Inkubieren Sie bei 30 °C für 2 Stunden in einem tagaktiven Inkubator unter Tageslichtbedingungen, um optimale Lichtverhältnisse für die Beute zu gewährleisten.
   5. Waschen Sie Zebrafische mindestens 5 Mal, indem Sie Fische in einen neuen Brunnen mit 3 ml frischem E3 mit jeweils 100 mg/L Trikain umleiten.
      HINWEIS: Versuchen Sie nicht, das Trikain während des Waschschritts wegzulassen. Die Übertragung mobiler Larven ohne Betäubung erhöht das Risiko von Schäden und Belastungen für das Tier.
   6. Optional bereiten Sie Zebrafische für die Bildgebung vor, indem Sie Zebrafische in 3 mL 1 % niedrigschmelzendes Agarose in eine schwarzwandige 6-Well-Platte einbetten: Niedrigschmelz-Agarose wird in 1xE3 hergestellt und in der Mikrowelle erhitzt. Nach dem Schmelzen geben Sie Tricain zu einer Endkonzentration von 160 mg/mL. Positioniere die Fische unter einem Stereomikroskop mit einer abgeschnittenen Gel-Ladespitze, wobei du darauf achtest, dass der Kopf links und der Schwanz rechts liegt (Abbildung 1). Warte 5 Minuten, bis die Agarose fest ist, und überlagere dann den eingebetteten Fisch mit 1x E3 mit 160 mg/mL Tricain zur Bildgebung.

Ergebnisse

Abbildung 1: Besiedlung von Zebrafischen mit Bakterien. Zebrafische mit 5 dpf blieben uninfiziert (A) oder wurden mit mCherry besiedelt, das (B) E. coli oder (C) Salmonella enter...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Paramecium caudatum, live	Carolina	131554	Nein, keine Anbaukulturen unter Zimmertemperatur lagern
0,4%ige Trypan-Blau-Lösung	Sigma	T8154-20ML	flüssig, steril gefiltert, geeignet für Zellkultur; hergestellt in 0,81 % Natriumchlorid und 0,06 % Kaliumphosphat, Dibasisk,
Dimethylsulfoxidid (DMSO)	Sigma	276855-100ML	Lagerung in einem lösungsmittelsicheren Schrank
Escherichia coli, MG1655	ATCC	ATCC 700926	kann durch jeden anderen nicht-pathogenen E.-coli-Stamm ersetzt werden
FM 4-64FX Fleck	Thermo Fisher	F34653	Aliquot und gefrorene Lagerung
Formaldehyd	Sigma	F8775-4X25ML
LB Broth	Sigma	L3397-1KG
Phosphatgepufferte Kochsalzlösungstabletten	Thermo Fisher	18912014
Tetracyclin	Sigma	87128-25G	Giftig, reizend
Trikain (Ethyl-3-Aminobenzoat-Methanesulfonat)	Sigma	E10521-10G
Triton X-100	Sigma	X100-100ML
Trypan Blaue Lösung, 0,4 %	Sigma	93595-50ML
UltraPure Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt	Thermo Fisher	16520050
Hämozytometer oder Zellzähler	Jede
Stereomikroskop	Jede
Tischzentrifuge
Mikrowelle
Rotatorenrad
Beheizter Schüttel-Inkubator
Aquatische Einrichtungen
Brutbecken