Entwicklung eines bakteriellen Monoschicht-Biofilms mit einem elektrochemischen Reaktor

Zusammenfassung

Quelle: Tokunou, Y. et al., Elektrochemische Detektion des Deuterium-kinetischen Isotopeneffekts auf den extrazellulären Elektronentransport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert den Zusammenbau und Betrieb eines elektrochemischen Reaktormodells, das zur Simulation der Biofilmbildung auf Elektrodenoberflächen entwickelt wurde. Kontrollierte elektrochemische Stimulation fördert die mikrobielle Adhäsion, was zur allmählichen Entwicklung eines bakteriellen Monoschicht-Biofilms führt.

Protokoll

1. Bau eines elektrochemischen Reaktors mit drei Elektroden (Abbildung 1)
   1. Setzen Sie ein Indium-Zinn-dotiertes Oxidsubstrat (ITO) als Arbeitselektrode am Boden des Reaktors.
   2. Anschließend wird ein Glaszylinder (Durchmesser 2 cm) und eine Polytetrafluorethylenabdeckung (PTFE) eingesetzt. Anschließend werden Silber-/Silberchlorid (Ag/AgCl) (Kaliumchlorid, KCl-gesättigt) und ein Platindraht als Referenz- bzw. Gegenelektrode in den Reaktor eingeführt.
      HINWEIS: Um das Austreten von Luft und Lösung zu verhindern, wird zwischen jede Komponente eine Butylgummifolie gelegt.
   3. Gib 4,0 ml definiertes Medium (DM) mit 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefeextrakt in den elektrochemischen Reaktor ein.
   4. Nachdem bestätigt wurde, dass kein Leck aus dem elektrochemischen Reaktor vorliegt, wird das Stickstoffgas über 20 Minuten in den elektrochemischen Reaktor geleitet, um anaerobe Bedingungen im elektrochemischen Reaktor aufrechtzuerhalten.
      HINWEIS: Um eine Kontamination mit anderen Mikroben zu verhindern, sollte das Gas gefiltert werden, bevor es in den elektrochemischen Reaktor gelangt.
   5. Verbinden Sie den elektrochemischen Reaktor mit einem Potentiostat und übertragen Sie +0,4 V (im Gegensatz zur Standardwasserstoffelektrode, SHE) auf die ITO-Elektrode, wobei die Temperatur des elektrochemischen Reaktors mit einem externen Wasserzirkulationssystem bei 30 °C gehalten wird.
      HINWEIS: Um die Wirkung eines externen elektrischen Feldes zu verhindern, sollte der elektrochemische Reaktor in einem Faradayschen Käfig platziert werden.
2. Elektrochemische Kultivierung von S. oneidensis MR-1-Zellen (Abbildung 1 und Abbildung 2)
   1. Stellen Sie die Zelldichte der in Schritt 1.1 gewonnenen Suspension auf eine optische Dichte von 1,43 bei 600 nm (OD₆₀₀) mit DM an, ergänzt durch 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefeextrakt.
      HINWEIS: Um den korrekten OD₆₀₀ zu erhalten, wenden Sie die Zellsuspension von OD₆₀₀ ≤ 0,8 auf ein UV-Vis-Spektrometer an, bevor der OD₆₀₀ auf 1,43 eingestellt wird.
   2. Fügen Sie 0,3 ml der Zellsuspension durch den Einspritzport mit einer Spritze in den elektrochemischen Reaktor ein: Das OD₆₀₀ im Reaktor ändert sich auf 0,1.
      HINWEIS: Die Zugabe von 0,3 mL Zellsuspension mit OD₆₀₀ = 1,43 in einen elektrochemischen Reaktor mit 4,0 mL Medium ergibt 4,3 mL Lösung mit einem OD₆₀₀ = 0,1. Bei Verwendung anderer Reaktoren mit unterschiedlichen Volumina ist die Berechnung der Zelldichte erforderlich.
   3. Die potenzielle Anwendung bei +0,4 V (gegenüber SHE) auf die ITO-Elektrode für 25 Stunden fortsetzen.
      HINWEIS: Für die Bildung eines Monoschicht-Biofilms auf einer ITO-Elektrode wird darauf geachtet, dass der erzeugte Strom eine Abweichung von weniger als 50 % von Abbildung 2 aufweist.

Ergebnisse

Abbildung 1: Elektrochemischer Reaktor, der in dieser Studie verwendet wird. Fotografie der elektrochemischen Zelle vor dem Bau (a) und nach dem Bau (b). (c) Schematische Darstellung des elektrochemischen Reaktors nach 25 Stunden elektrochemischer Inoku...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Glaszylinder	N/A	N/A	Maßgefertigt, als elektrochemischer Reaktor verwendet
PTFE-Deckung und Basis	N/A	N/A	Maßgefertigt, als Abdeckung und Fundament für den elektrochemischen Reaktor verwendet
Buthylkautschuk	N/A	N/A	Maßgefertigt, zwischen jede Komponente des elektrochemischen Reaktors eingesetzt
Septa	GL Science	3007-16101	Verwendung als Einspritzport eines elektrochemischen Reaktors
Indiumzinn-dotierte Oxidelektrode (ITO)	GEOMATEC	Nr. 0001	Verwendet als Arbeitselektrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl-gesättigte Elektrode	HOKUTO DENKO	HX-R5	Als Referenzelektrode verwendet, Φ0,30 mm
Platindraht	Die Nilaco-Kooperation	PT-351325	Verwendung als Gegenelektrode
Luria-Bertani (LB) Brühe, Miller	Becton, Dichkinson und Company	244620	Medium für die Vorkultivierung von S. oneidensis MR-1
Bacto-Agar	Becton, Dichkinson und Company	214010
NaHCO₃	Wako	191-01305	Verwendet für definiertes Medium (DM)
CaCl₂·2H₂O	Wako	031-00435	Für DM verwendet
NH₄Cl	Wako	011-03015	Für DM verwendet
MgCl₂·6H₂O	Wako	135-00165	Für DM verwendet
NaCl	Wako	191-01665	Für DM verwendet
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl] Ethanesulfonsäure (HEPES)	DOJINDO	346-08235	Für DM verwendet
Natriumlaktatlösung	Wako	195-02305
Bacto-Hefeextrakt	Becton, Dichkinson und Company	212750
Deuteriumoxid (D, 99,9 %)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-PK	Additiv für kinetische Isotopeneffektexperimente
Inkubator	TOKIO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	Verwendung für die Vorkultivierung
Shaker	TAITEC	NR-3	Verwendung für die Vorkultivierung
Autoklavenmaschine	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Verwendet zur Sterilisation des elektrochemischen Reaktors und des Mediums
Saubere Bank	SANYO	MCV-91BNF	Eingesetzt, um die Kontamination des elektrochemischen Reaktors und des Mediums mit anderen Mikroben zu verhindern
Zentrifugentrenner	Eppendorf	5430R	Eine Drehzahl von bis zu 6000×g ist erforderlich
Stickstoffgasgenerator	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	Eine Stickstoffgasflasche kann ebenfalls anstelle eines Gasgenerators verwendet werden
UV-Vis-Spektrometer	SHIMADZU	UV-1800	Verwendet zur Optimierung der Zelldichte
Potentiostat	BioLogic	VMP3	Verwendung für Biofilmbildung und kinetische Isotopeneffekt-Experimente
Thermischer Wasserzirkulator	ALS EINHEIT	TR-1A	Verwendet zur Temperaturaufrechterhaltung eines elektrochemischen Reaktors
Faradayscher Käfig	HOKUTO DENKO	HS-201S	Verwendung für elektrochemische Experimente