Visualisierung von pathogeninduziertem oxidativem Stress in C. elegans mit GFP-markierten SKN-1

Zusammenfassung

Quelle: Naji, A. et al. Untersuchung des oxidativen Stress, der durch die Mitisgruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans verursacht wird. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert die Verwendung von grün fluoreszierendem Protein markierten SKN-1 in C. elegans zur Überwachung oxidativen Stresses durch Verfolgung der grünen Fluoreszenz. Würmer, die S. gordonii ausgesetzt waren, zeigen eine starke nukleare Fluoreszenz, was pathogeninduzierten Stress bestätigt, während diejenigen, die mit E. coli gefüttert werden, diffuse grüne Fluoreszenz im Zytoplasma zeigen, was auf eine minimale SKN-1-Aktivierung hinweist.

Protokoll

1. Beobachtung der SKN-1-Lokalisierung als Reaktion auf eine Streptococcus-gordonii-Infektion

1. Fügen Sie ~100 L4-L4-Larven zu jedem Todd–Hewitt-Hefeextrakt (THY), das mit Streptococcus besät ist, sowie zu jedem mit Escherichia coli (E. coli) besäten Agarplatten (NGM) ~100 L4-Larven hinzu. Verwenden Sie drei Platten pro Bakterienstamm. Inkubieren Sie die Platten 2 bis 3 Stunden bei 25 °C.
2. Anschließend werden die Platten aus dem Inkubator entfernt, mit einem modifizierten M9-Puffer (M9W) gewaschen und die Würmer in 15-mL konischen Röhren gesammelt.
3. Wasche die Würmer dreimal.
4. Entfernen Sie den Großteil des M9W durch Aspiration und geben Sie 500 μL M9W mit 2 mM Natriumazid oder 2 mM Tetramisolhydrochlorid zum Wurmpellet. Dies betäubt die Würmer und stellt sicher, dass sich beim Mikroskopbild keine Bewegung bewegt.
   VORSICHT: Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) beim Umgang mit Natriumazid. Bereiten Sie die Azidlösung unter einer chemischen Haube vor.
5. Inkubieren Sie die Wurmpellets bei Zimmertemperatur (RT) für 15 Minuten. Dann wird 15 μL der Schneckensuspension auf ein vorbereitetes Agarose-Pad gelegt. Legen Sie vorsichtig einen Nr. 1.5-Deckdeckel über das Agarose-Pad mit den betäubten Würmern.
6. Mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren Sie die Lokalisierung des Transkriptionsfaktorfaktors 1 der Skinhead-Familie oder SKN-1:GFP (Green Fluorescent Protein-tagged SKN-1) unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)-Filtern. Bildwürmer mit 10- und 20-facher Vergrößerung.
7. Bewerten Sie die Würmer basierend auf dem Lokalisierungsgrad von SKN-1. Keine nukleare Lokalisation, die Lokalisierung von SKN-1B/C::GFP (Green Fluorescent Protein-tagged SKN-1 Isoform B/C) im vorderen oder hinteren Bereich des Wurms sowie die nukleare Lokalisierung von SKN-1B/C::GFP in allen Darmzellen werden als niedrige, mittlere und hohe Lokalisationsstufen kategorisiert.
8. Nach der Bewertung der fluoreszierenden Mikrographen werden die statistischen Unterschiede mittels Chi-Quadrat- und Fisher-exakten Tests mit statistischer Software bestimmt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Medien und Chemikalien
BD Bacto Todd Hewitt Brühe	Fisher Scientific	DF0492-17-6
15 mL konische, sterile Polypropylen-Zentrifugenröhren	Fisher Scientific	12-565-269
Natriumazid	Sigma Aldrich	S2002-25G
Tetramisolhydrochlorid	Sigma Aldrich	L9756
Nr. 1.5 18 mm x 18 mm Abdeckungen	Fisher Scientific	12-541A
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell