Vorbereitung eines murinen Oropharyngeal-Aspirationsmodells zur Etablierung bakterieller Lungeninfektionen

Zusammenfassung

Quelle: Nielsen, T. B., et al., Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Beatmator-assoziierte und im Krankenhaus erworbene bakterielle Pneumonie. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert das Verfahren, bei dem Bakterien über den Oropharynx in die Lunge einer anästhesierten Maus geleitet werden, um eine Lungeninfektion auszulösen und eine Immunantwort auszulösen.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.

1. Impfung/Infizieren von Mäusen

1. Hängen Sie eine betäubte Maus auf und hängen sie an ihren oberen Schneidezähnen an einer starken, dünnen Schnur (z. B. Zahnseide), die an einem festen Gegenstand befestigt ist, in einer etwa doppelt so hohen Höhe wie die Körperlänge der Maus (z. B. 20 cm) über der Arbeitsfläche (z. B. Labortisch).
2. Ziehen Sie vorsichtig die Zunge der Maus mit einer sterilen, stumpfen Zange aus dem Maul. Übertragen Sie die Zunge auf einen sterilen, behandschuhten Finger, um ein versehentliches Zerquetschen der Zunge der Maus zu verhindern. Halten Sie die Zunge außerhalb des Mundes, um Zugang zum Oropharynx zu ermöglichen und das Verschlucken des Inokulums seitlich zu verhindern.
3. Während man die Mauszunge hält, wird das 50-μL-Inokulum (bakterielle Suspension) mit einer Mikropipette in den Oropharynx eingesetzt; Der Oropharynx befindet sich an der Verbindung von Mundhöhle und Pharynx gegenüber dem hinteren Teil des Mundes.
   HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die Flüssigkeit nur durch Pipettern an die erste Haltestelle der Mikropipette zu liefern. Die Maus hört für einige Sekunden auf zu atmen, wenn das Inokulum im Oropharynx eingesetzt wird; Schließlich führt reflexive Aspiration dazu, dass die Maus die bakterielle Suspension einatmet, was sich durch das charakteristische Knistern der in die Lunge eintretenden Flüssigkeit zeigt, was zu einer Lungenentzündung führt.
4. Befindet sich das Inokulum nicht weit genug zurück, um die normale Atmung zu blockieren, kneifen Sie die Nasennässe mit einer Pinzette, um eine reflexartige Aspiration durch den Mund und das anschließende Einatmen des Inokulums zu erzwingen.
5. Nach der Impfung wird die Zunge losgelassen, die Maus von der Schnur genommen, in einen Käfig gesetzt und überwacht, bis sie aus der Narkose erwacht.

2. Überwachung des Krankheitsverlaufs

HINWEIS: Aufgrund des Tierleidens sollten verschiedene Indikatoren verwendet werden, um anzuzeigen, wann Mäuse sterben; Die Euthanasie sollte nach dieser Feststellung gemäß einem zuvor genehmigten IACUC-Protokoll durchgeführt werden; Verschiedene Marker der Sterblichkeit umfassen Körpertemperatur, Gewichtsverlust, Aussehen, Gang und andere Biomarker, die aus Blut gewonnen werden können (z. B. über iSTAT).

1. Eliminieren Sie die Mäuse gemäß dem zuvor genehmigten IACUC-Protokoll (z. B. _CO-2 gefolgt von zervikaler Verrenkung).
2. Entfernen Sie die Lunge einer eingeschläferten Maus, indem Sie die Luftröhre, die Lungenarterie und die Lungenvene in der Nähe der Lunge durchschneiden.
   1. Mikroskopie
      1. Setzen Sie die Lunge (oder den Teil) in eine Probeform.
      2. Füllen Sie die Probeform mit optimaler Schneidetemperatur (O.C.T.)-Masse und tauchen Sie das Gewebe vollständig ein.
      3. Kühlen Sie die Probe bei -80 °C ein.
      4. Schicken Sie die Probe in ein Pathologielabor, um Objektträger für eine Mikroskopie zu schneiden und auf Objektträger zu montieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kammer für Anästhesie	Kent Wissenschaftliche Gesellschaft	VetFlo-0720	Bietet Platz für bis zu 5 Mäuse
Cryomold, mittlere Größe	Sakura Tissue-Tek	4566	Einweg-Vinyl-Probenformen, 15×15×5 mm
Zahnseide	Oral-B	37000469537	Binden Sie den stabilen Pfosten ca. 15 cm über der Tischhöhe fest
Pinzette	VWR	82027-440	Früher zog ich vorsichtig die Zunge aus dem Mausmund.
Isofluran zur Anästhesie	Abbott	10015516	Alternative Drogen können verwendet werden; Anpassung des Verfahrens entsprechend
iSTAT-Patrone	Abbott	03P79-25	Verschiedene Patronen sind für Ihre Bedürfnisse erhältlich
Ketamin, 100 mg/mL	Westliche Medizinische Versorgung	4165	Verdünne 1:10 in PBS auf 1 mg/mL und vermische mit Xylazin bei 1 mg/mL
Salbe für die Augen	Akorn	Tränen erneuert	Vermeiden Sie es, mit der Spitze des Spenders das Auge zu berühren
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Corning	21-031-CM	Dulbeccos PBS ohne Kalzium und Magnesium
Pipettenspitzen, 200-μL	VWR	10017-044	Autoklav vor der Nutzung
Pipetter, 200-μL	Gilson	Pipetman P200	Autoklav und kalibrieren Sie vor der Nutzung
Spreader, Bakterienzelle	Bel-Art	F377360006	Sterilisieren Sie vor jeder Anwendung durch Backen oder Autoklaven
Fläschchen, kryogen, 2,0 ml	Corning	430659	Verwendet zur kryogenen Lagerung konzentrierter bakterieller Inokula