Lichtaktivierte Behandlung bakterieller Biofilme mit einem Photosensibilisator-Vorläufer

Zusammenfassung

Quelle: Zhao, K. et al. Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der Wirkung der 5-Aminolevulinsäure-vermittelten photodynamischen Therapie auf den Biofilm von Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)

Das Video demonstriert ein photodynamisches Therapieprotokoll zur Bewertung antibakterieller Effekte auf Gram-positive bakterielle Biofilme. Biofilme werden in vier Gruppen unterteilt: Zwei erhalten einen Photosensibilisierer-Vorläufer, zwei erhalten einen Puffer. Alle werden im Dunkeln inkubiert, gefolgt von einer mit Vorläufer behandelten und einer nur pufferbesetzten Gruppe. Reaktive Sauerstoffspezies entstehen nur in der Gruppe, die sowohl Vorläufer als auch Licht erhält, was zum bakteriellen Zelltod führt. Die Lebensfähigkeit wird über alle Gruppen hinweg verglichen, um die Wirksamkeit der Behandlung zu bewerten.

Protokoll

1. Biofilmbildung

1. Biofilmbildung in 96-Brunnen-Mikroplatten
   1. Holen Sie den Staphylococcus aureus-Stamm USA300 und 3 biofilmbildende klinische Stämme (C1-C3) ab, die bei -80 °C gelagert werden.
      HINWEIS: Die Fähigkeit der klinischen Stämme, Biofilme zu bilden, wurde durch den Mikrotiterplatten-Test bestimmt.
   2. Inokulieren Sie das Bakterium in einem 5-mL Trypton-Sojabrühe (TSB)-Medium und kultivieren Sie es in einem Inkubator mit einem Schütteln bei 37 °C über Nacht bis zur stationären Phase.
   3. Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur über Nacht bei 4.000 × g für 10 Minuten bei 25 °C und entsorgen Sie den Supernatant. Die Pellets werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 2,0 × 10 9 Koloniebildenden Einheiten (CFU)/ml wieder suspendiert.
      HINWEIS: Die Konzentration der Bakterien wurde durch Messung der optischen Dichte geschätzt und weiter anhand der Plattenanzahl bestimmt, wobei 1 OD₆₀₀ Suspension 1,5 × 108^CFU /ml enthielt.
   4. Verdünnen Sie die bakterielle Suspension auf 1:200 (1,0 × 10⁷ CFU/mL) in TSB-Medium mit 0,5 % Glukose. Inokulieren Sie 200 μL bakterielle Suspension in jede Brunnen einer zellkulturbehandelten Polystyrol-96-Well-Mikroplatte.
   5. Inkubieren Sie die Mikroplatte statisch bei 37 °C für 24 Stunden in einer gut sauerstoffreichen Umgebung.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit für die Bildung reifer Biofilme kann je nach Bakterienstämm variieren; dies sollte vor dem Photodynamischen Therapie-(PDT)-Experiment bestimmt werden.
   6. Entsorge das Medium in den Brunnen und wasche die Mikroplatten-Mulden vorsichtig dreimal mit PBS und entsorge dann das Supernatant.
      HINWEIS: Der Schritt sollte sehr vorsichtig ausgeführt werden, um die gebildete Biofilm nicht zu stören.

2. Lichtbestrahlung

1. Lagern Sie 5-Aminolevulinsäure (5-ALA) in einem Kühlschrank mit 4 °C. Vor dem Experiment sollte 5-ALA mit PBS auf 10 mM verdünnt werden.
   HINWEIS: Die 5-ALA-Lösung sollte vor dem Experiment frisch vorbereitet werden.
2. In der Versuchsgruppe wird 200 μL 10 mM ALA zu jedem Bohrloch der Mikroplatte oder 2 mL zur Kulturschale hinzugefügt. Decke den Teller/die Schale mit Alufolie ab und brüte sie 1 Stunde lang aus. Anschließend wird die Platte/Schüssel mit einer Leuchtdiode (LED) mit einer Lichtintensität von 100 mW/^cm2 für 1 Stunde bestrahlt, um eine Lichtdosis von 360 J/cm² bei einer Hauptwellenlänge von 633 ± 10 nm zu erreichen.
   HINWEIS: Um die Lichtenergie effektiv und gleichmäßig an den Biofilm in allen Brunnen/Schüsseln zu übertragen, sollte der Abstand vom Gipfel der Lichtquelle zum Brunnen/Schüssel auf 6,0 cm festgelegt werden und der Versuchsbereich auf den zentralen Bestrahlungsbereich (10 cm × 8 cm) begrenzt werden. Um sicherzustellen, dass die Ergebnisse reproduzierbar sind, sollten die Experimente bei derselben Raumtemperatur durchgeführt werden. Im LED-Bestrahlungsschritt wurde die LED eingeschaltet, um die direkte Exposition der Platte gegenüber anderen Lichtquellen wie Sonnenlicht, Raumbeleuchtung oder Lampenlicht zu vermeiden, bevor die Platte/Schüssel in den Bestrahlungsbereich bewegt wurde, und das Licht war hell genug, um den Vorgang zu beenden.
3. Richtete die Kontrollgruppen ein (in unserem Experiment wurden drei Kontrollgruppen eingerichtet).
   1. Für die erste Kontrollgruppe (ALA-LED-) geben Sie 200 μL PBS zu jeder Bohrung der Mikroplatte oder 2 ml zur Kulturschale. Decke den Teller/die Schüssel mit Alufolie ab und inkubiere sie 2 Stunden lang.
   2. Für die zweite Kontrollgruppe (ALA+LED-) werden 200 μL 10 mM ALA in jede Mulde der Mikroplatte oder 2 mL in die Kulturschale gegeben. Decke den Teller/die Schüssel mit Alufolie ab und inkubiere sie 2 Stunden lang.
   3. Für die dritte Kontrollgruppe (ALA-LED+) geben Sie 200 μL PBS zu jedem Bohrloch der Mikroplatte oder 2 ml zur Kulturschale. Decke den Teller/die Schüssel mit Alufolie ab und befruchte sie 1 Stunde lang. Anschließend wird die Platte der LED mit 360 J/cm² Lichtbestrahlung bei einer Hauptwellenlänge von 633 ± 10 nm belichtet.
      HINWEIS: Im LED-Bestrahlungsschritt vermeiden Sie die direkte Exposition der Platte gegenüber anderen Lichtquellen wie Sonnenlicht, Raumbeleuchtung oder Lampenlicht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Trypton-Sojabrühe (TSB)	OXOID	CM0129B
SYTO9	Thermo Fisher Scientific	L7012	Die LIVE/DEAD BacLight bakteriellen Lebensfähigkeitskits
Propidiumiodid (PI)	Thermo Fisher Scientific	L7012	Die LIVE/DEAD BacLight bakteriellen Lebensfähigkeitskits
5-Aminolevulinsäure (ALA)	Fudan Zhangjiang Bio-Pharm	3.1
Staphylococcus aureus-Stamm USA300			USA 300 Referenzen
Klinische Stämme von Staphylococcus aureus (C1-C3)			Alle klinischen Stämme wurden von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis isoliert
96-Bohrloch-Mikroplatten	Corning Inc	3599	Klare, flache Polystyrol-TC-behandelte Mikroplatten, einzeln umwickelt, mit Deckel, steril
Eppendorfer Mikrozentrifuge 5417	Eppendorf	Z365998 | SIGMA
Inkubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000	MaxQ 4000 Tisch-Orbitalshaker
Leuchtdiode (LED)	Wuhan Yage Optische und Elektronische Technik CO	LED-IB